إعادة تشكيل تجميع السبعين في الأغشية لدراسة الخصائص والوظائف الفيزيائية الحيوية
Summary
كانت إعادة التشكيل الخالية من الخلايا أداة رئيسية لفهم تجميع الهيكل الخلوي ، وقد أنشأ العمل في العقد الماضي مناهج لدراسة ديناميكيات السيبتين في الحد الأدنى من الأنظمة. تظهر هنا ثلاث طرق تكميلية لمراقبة تجميع السيتين في سياقات غشائية مختلفة: الطبقات الثنائية المستوية ، والدعامات الكروية ، ودعامات القضيب.
Abstract
يمكن لمعظم الخلايا استشعار وتغيير شكلها لتنفيذ عمليات الخلايا الأساسية. في العديد من حقيقيات النوى ، يعد الهيكل الخلوي للسبتين جزءا لا يتجزأ من تنسيق تغيرات الشكل مثل الحركة الخلوية والنمو المستقطب والهجرة. Septins هي بروتينات مكونة للخيوط تتجمع لتشكيل هياكل متنوعة ذات ترتيب أعلى ، وفي كثير من الحالات ، توجد في مناطق مختلفة من غشاء البلازما ، وعلى الأخص في مناطق الانحناء الإيجابي على نطاق ميكرون. ويعوق رصد عملية تجميع السيبتين في الجسم الحي قيود الفحص المجهري الضوئي في الخلايا، فضلا عن تعقيد التفاعلات مع كل من الأغشية والعناصر الهيكلية الخلوية، مما يجعل من الصعب تحديد ديناميات السيتين في النظم الحية. لحسن الحظ ، كان هناك تقدم كبير في العقد الماضي في إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للسبتين في نظام خال من الخلايا لتشريح الآليات التي تتحكم في تجميع السيبتين بدقة مكانية وزمنية عالية. تشمل الخطوات الأساسية لتجميع السيبتين ارتباط السيبتين غير المتجانس وانفصاله عن الغشاء ، والبلمرة إلى خيوط ، وتشكيل هياكل أعلى مرتبة من خلال التفاعلات بين الخيوط. هنا ، نقدم ثلاث طرق لمراقبة تجميع السيتين في سياقات مختلفة: الطبقات الثنائية المستوية ، والدعامات الكروية ، ودعامات القضيب. يمكن استخدام هذه الطرق لتحديد المعلمات الفيزيائية الحيوية للسبتين في مراحل مختلفة من التجميع: كأوكتامات مفردة تربط الغشاء ، كخيوط ، وكتجمعات للخيوط. نحن نستخدم هذه المعلمات مقترنة بقياسات أخذ عينات الانحناء والامتزاز التفضيلي لفهم كيفية عمل استشعار الانحناء على مجموعة متنوعة من مقاييس الطول والوقت.
Introduction
تعتمد أشكال الخلايا والعديد من مقصوراتها الداخلية على الأغشية الدهنية المحيطة بها. الأغشية هي هياكل مرنة لزجة يمكن تشويهها من خلال التفاعلات مع البروتينات وفرز الدهون والقوى الداخلية والخارجية المؤثرة لتوليد مجموعة متنوعة من الأشكال1،2،3،4. غالبا ما يتم وصف هذه الأشكال من حيث انحناء الغشاء. تستخدم الخلايا مجموعة متنوعة من البروتينات القادرة على تجميع الانحناءات الغشائية الخاصة بشكل تفضيلي أو “الاستشعار” لضمان التحكم المكاني الزماني المحدد في العمليات بما في ذلك الاتجار بالخلايا والحركة الخلوية والهجرة 5,6. من الصعب بشكل ملحوظ مراقبة ديناميكيات آلات الخلايا في الغشاء بسبب صعوبة تحقيق التوازن بين الوقت والدقة المكانية مع صحة الخلية. في حين أن تقنيات الدقة الفائقة يمكن أن تقدم عرضا مفصلا لهذه الهياكل ، إلا أنها تتطلب عمليات استحواذ طويلة غير قابلة للجداول الزمنية للتجميع / التفكيك لمعظم الآلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعقيد الجزيئي لهذه التجمعات في بيئتها الأصلية والعديد من الأدوار التي يمكن أن يلعبها مكون واحد يجعل أنظمة إعادة التشكيل الدنيا أداة قيمة لدراسة القدرة الوظيفية للجزيئات.
تم تطوير الحد الأدنى من محاكاة الغشاء لدراسة خصائص الغشاء والتفاعلات بين البروتين والغشاء خارج الخلية. تختلف محاكيات الأغشية من الطبقات الثنائية للدهون القائمة بذاتها ، مثل الجسيمات الشحمية أو الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة ، إلى الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) 7،8،9،10. SLBs هي أغشية محاكاة حيوية ترتكز على الدعم الأساسي ، وتتكون عادة من الزجاج أو الميكا أو السيليكا11،12. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الهندسات، بما في ذلك الأسطح المستوية، والكرات، والقضبان، وحتى الركائز المتموجة أو المجهرية لفحص تفاعلات غشاء البروتين على كل من الانحناءات المقعرة والمحدبة في وقت واحد13،14،15،16،17،18 . يبدأ تكوين الطبقة الثنائية بامتصاص الحويصلة على سطح محب للماء ، يليه الانصهار والتمزق لتشكيل طبقة ثنائية مستمرة (الشكل 1)19. الطبقات الثنائية المدعومة قابلة بشكل خاص للضوء والمجهر الإلكتروني ، مما يوفر وقتا أفضل ودقة مكانية أفضل مما يمكن تحقيقه في كثير من الأحيان في الخلايا. توفر SLBs المنحنية بشكل خاص وسيلة جذابة لفحص حساسية انحناء البروتين في غياب تشوه غشائي كبير ، مما يسمح للمرء بالتمييز بين استشعار الانحناء وتحريض الانحناء ، والتي غالبا ما يكون من المستحيل فصلها في الأنظمة القائمة بذاتها.
Septins هي فئة من البروتينات الخلوية الهيكلية المكونة للخيوط المعروفة جيدا بقدرتها على التجمع على أغشية منحنية بشكل إيجابي 6,18,20. على مدار دورة الخلية في الخميرة ، تتجمع السيبتين في حلقة ويجب إعادة ترتيبها لتشكيل الساعة الرملية وهياكل الحلقة المزدوجة المرتبطة بظهور البراعم والحركة الخلوية ، على التوالي21. في حين تم القيام بعمل جميل باستخدام المجهر الإلكتروني المقلد البلاتيني لمراقبة بنية السيتين في مراحل دورة الخلية المختلفة22 ، فإن مشاهدة تجميع السبتين بمرور الوقت باستخدام المجهر الضوئي في الخميرة قد لاقت دقة مكانية محدودة. كان العمل السابق على السيبتين باستخدام الطبقات الأحادية الدهنية التي تم تصورها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) قادرا على إعادة تشكيل العديد من هياكل السيبتين المثيرة للاهتمام مثل الحلقات والحزم والشاش23. ومع ذلك ، فإن تقنيات EM محدودة أيضا في دقتها الزمنية ، على عكس الفحص المجهري الفلوري. من أجل حل أفضل للمعلمات الحركية للعملية متعددة المقاييس لتجميع السيبتين ، تحولنا إلى محاكاة الغشاء المدعومة ، حيث يمكن للمرء التحكم بعناية في هندسة الغشاء ، وظروف العينة ، وطريقة التصوير.
تستخدم البروتوكولات الموضحة هنا SLBs المستوية أو المنحنية ، والبروتين النقي ، ومزيج من تقنيات الفحص المجهري. تم استخدام المجهر البؤري الفلوري الكمي والمجهر الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) لقياس كل من ارتباط البروتين السائب بانحناءات الغشاء المختلفة ، وكذلك لقياس حركية الربط للجزيئات المفردة. علاوة على ذلك ، تم تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لفحص البنية الفائقة للبروتين على انحناءات الغشاء المختلفة. في حين أن تركيز هذه البروتوكولات ينصب على الهيكل الخلوي للسيبتين ، يمكن تعديل البروتوكولات بسهولة للتحقيق في حساسية الانحناء لأي بروتين يجده القارئ مثيرا للاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، قد يجد أولئك الذين يعملون في مجالات مثل كثرة الخلايا الداخلية أو الاتجار بالحويصلات هذه التقنيات مفيدة للتحقيق في التجمعات المعتمدة على الانحناء للمجمعات متعددة البروتينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تأخذ أغشية الخلايا العديد من الأشكال المختلفة والانحناءات والخصائص الفيزيائية الكيميائية. من أجل دراسة الآلات على نطاق النانومتر التي من خلالها تبني الخلايا تجمعات على نطاق ميكرومتر ، من الضروري تصميم الحد الأدنى من أنظمة إعادة التشكيل لمحاكاة الأغشية. يقدم هذا البروتوكول تقنيات تتحكم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) Grant No. R01 GM-130934 والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة MCB- 2016022. تم دعم B.N.C ، E.J.D.V. ، و K.S.C. جزئيا من خلال منحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة بموجب الجائزة T32 GM119999.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
