Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Las formas de las células y muchos de sus compartimentos internos dependen de las membranas lipídicas que las rodean. Las membranas son estructuras viscoelásticas que pueden deformarse a través de interacciones con proteínas, clasificación de lípidos y fuerzas internas y externas que actúan para generar una variedad de formas 1,2,3,4. Estas formas a menudo se describen en términos de curvatura de la membrana. Las células utilizan un conjunto diverso de proteínas capaces de ensamblar preferentemente o “detectar” curvaturas de membrana particulares para garantizar un control espacio-temporal definido sobre procesos que incluyen tráfico celular, citocinesis y migración ^5,6. La dinámica de la maquinaria celular en la membrana es notablemente difícil de observar debido a la dificultad de equilibrar el tiempo y la resolución espacial con la salud celular. Si bien las técnicas de superresolución pueden ofrecer una visión detallada de tales estructuras, requieren adquisiciones prolongadas que no son susceptibles a las escalas de tiempo de ensamblaje / desmontaje para la mayoría de la maquinaria. Además, la complejidad molecular de estos ensamblajes en su entorno nativo y la multitud de funciones que puede desempeñar un solo componente hacen que los sistemas de reconstitución mínima sean una herramienta valiosa para estudiar la capacidad funcional de las moléculas.

Se han desarrollado miméticos mínimos de membrana para estudiar las propiedades de la membrana y las interacciones proteína-membrana fuera de la célula. Los miméticos de membrana varían desde bicapas lipídicas independientes, como liposomas o vesículas unilamelares gigantes, hasta bicapas lipídicas soportadas (SLB)7,8,9,10. Los SLB son membranas biomiméticas ancladas al soporte subyacente, típicamente compuestas de vidrio, mica o sílice ^11,12. Se puede utilizar una variedad de geometrías, incluidas superficies planas, esferas, varillas e incluso sustratos ondulados o micropatronados para sondear las interacciones proteína-membrana en curvaturas cóncavas y convexas simultáneamente¹ 3,14,15,16,17,18 . La formación de bicapa comienza con la adsorción de vesículas sobre una superficie hidrófila, seguida de fusión y ruptura para formar una bicapa continua (Figura 1)¹⁹. Las bicapas soportadas son particularmente susceptibles a la luz y la microscopía electrónica, proporcionando una mejor resolución temporal y espacial de lo que a menudo se puede lograr en las células. Los SLB curvos proporcionan especialmente un medio atractivo para sondear la sensibilidad a la curvatura de la proteína en ausencia de una deformación significativa de la membrana, lo que permite distinguir entre la detección de curvatura y la inducción de curvatura, que a menudo son imposibles de separar en sistemas independientes.

Las septinas son una clase de proteínas citoesqueléticas formadoras de filamentos bien conocidas por su capacidad de ensamblarse en membranas curvadas positivamente ^6,18,20. En el transcurso del ciclo celular en la levadura, las septinas se ensamblan en un anillo y deben reorganizarse para formar las estructuras de reloj de arena y doble anillo asociadas con la aparición de brotes y la citocinesis, respectivamente²¹. Si bien se ha realizado un hermoso trabajo utilizando microscopía electrónica de réplica de platino para observar la arquitectura de la septina en diferentes etapas del ciclo celular²², observar el ensamblaje de la septina a lo largo del tiempo utilizando la microscopía de luz en la levadura se ha encontrado con una resolución espacial limitada. Trabajos previos sobre septinas utilizando monocapas lipídicas visualizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron capaces de reconstituir varias estructuras de septina interesantes como anillos, haces y gasas²³. Sin embargo, las técnicas EM también están limitadas en su resolución temporal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia. Con el fin de resolver mejor los parámetros cinéticos del proceso multiescala de ensamblaje de septina, recurrimos a la mimética de membrana soportada, donde se puede controlar cuidadosamente la geometría de la membrana, las condiciones de la muestra y la modalidad de imagen.

Los protocolos descritos aquí utilizan SLB planos o curvos, proteína purificada y una combinación de técnicas de microscopía. La microscopía confocal de fluorescencia cuantitativa y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se utilizaron para medir tanto la unión de proteínas a granel en varias curvaturas de membrana, como para medir la cinética de unión de moléculas individuales. Además, este protocolo ha sido adaptado para ser utilizado con microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la ultraestructura de proteínas en diferentes curvaturas de membrana. Si bien el enfoque de estos protocolos está en el citoesqueleto de septina, los protocolos se pueden modificar fácilmente para investigar la sensibilidad a la curvatura de cualquier proteína que el lector encuentre interesante. Además, aquellos que trabajan en campos como la endocitosis o el tráfico vesicular pueden encontrar estas técnicas útiles para sondear los ensamblajes dependientes de la curvatura de complejos multiproteicos.