שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים
Summary
שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.
Abstract
רוב התאים יכולים לחוש ולשנות את צורתם כדי לבצע תהליכים בסיסיים בתאים. אצל אאוקריוטים רבים, שלד ספטין הוא מרכיב אינטגרלי בתיאום שינויי צורה כמו ציטוקינסיס, צמיחה מקוטבת והגירה. ספטינים הם חלבונים יוצרי נימה המתאספים ליצירת מבנים מגוונים מסדר גבוה יותר, ובמקרים רבים נמצאים באזורים שונים של קרום הפלזמה, בעיקר באזורים של עקמומיות חיובית בקנה מידה של מיקרון. ניטור התהליך של הרכבת ספטין in vivo מעוכב על ידי המגבלות של מיקרוסקופיית אור בתאים, כמו גם את המורכבות של אינטראקציות עם ממברנות ואלמנטים ציטוסקטליים, מה שמקשה על כימות דינמיקת ספטין במערכות חיות. למרבה המזל, בעשור האחרון חלה התקדמות משמעותית בשחזור שלד ספטין ציטוסקלטון במערכת נטולת תאים כדי לנתח את המנגנונים השולטים בהרכבת ספטין ברזולוציות מרחביות וטמפורליות גבוהות. שלבי הליבה של הרכבת ספטין כוללים אסוציאציה של ספטין הטרוליגומר ודיסוציאציה עם הממברנה, פולימריזציה לחוטים, והיווצרות מבנים מסדר גבוה יותר באמצעות אינטראקציות בין חוטים. כאן אנו מציגים שלוש שיטות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות. שיטות אלה יכולות לשמש לקביעת הפרמטרים הביופיזיים של ספטינים בשלבים שונים של הרכבה: כאוקטמרים בודדים הקושרים את הממברנה, כחוטים, וכמכלולים של חוטים. אנו משתמשים בפרמטרים אלה בשילוב עם מדידות של דגימת עקמומיות וספיחה מועדפת כדי להבין כיצד חישת העקמומיות פועלת במגוון קני מידה של אורך וזמן.
Introduction
צורות התאים ורבים מהתאים הפנימיים שלהם תלויים בקרום השומנים המקיפים אותם. ממברנות הן מבנים ויסקואלסטיים שניתן לעוות באמצעות אינטראקציות עם חלבונים, מיון שומנים, והפעלת כוחות פנימיים וחיצוניים ליצירת מגוון צורות 1,2,3,4. צורות אלה מתוארות לעתים קרובות במונחים של עקמומיות הממברנה. תאים משתמשים בחבילה מגוונת של חלבונים המסוגלים להרכיב באופן מועדף על עקמומיות ממברנה מסוימת, או “לחוש”, כדי להבטיח שליטה מרחבית-טמפורלית מוגדרת על תהליכים, כולל סחר בתאים, ציטוקינאזיס והגירה 5,6. הדינמיקה של מנגנוני התאים בממברנה קשה במיוחד לצפייה בשל הקושי לאזן בין זמן ורזולוציה מרחבית לבין בריאות התא. בעוד שטכניקות סופר-רזולוציה יכולות להציע תצוגה מפורטת של מבנים כאלה, הן דורשות רכישות ארוכות שאינן נוחות ללוחות הזמנים של הרכבה/פירוק עבור רוב המכונות. בנוסף, המורכבות המולקולרית של מכלולים אלה בסביבתם הטבעית ושלל התפקידים שרכיב יחיד יכול למלא הופכים את מערכות השיקום המינימליות לכלי רב ערך לחקר היכולת התפקודית של מולקולות.
פנטומימה מינימלית של ממברנות פותחה כדי לחקור את תכונות הממברנה ואת האינטראקציות בין חלבונים לממברנה מחוץ לתא. פנטומימה של ממברנה משתנה מדו-שכבתי שומנים העומדים בפני עצמם, כגון ליפוזומים או שלפוחיות יונילאמלריות ענקיות, ועד דו-שכבתיים נתמכים של שומנים (SLBs)7,8,9,10. SLBs הם ממברנות ביומימטיות המעוגנות לתמיכה בסיסית, המורכבות בדרך כלל מזכוכית, נציץ או סיליקה11,12. ניתן להשתמש במגוון גיאומטריות, כולל משטחים מישוריים, כדורים, מוטות, ואפילו מצעים גליים או מיקרו-מפולפלים כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים לממברנה על עקמומיות קעורה וקמורה בו זמנית13,14,15,16,17,18 . היווצרות דו-שכבתית מתחילה בספיגת שלפוחית על משטח הידרופילי, ולאחר מכן בהיתוך וקרע ליצירת דו-שכבתי רציף (איור 1)19. דו-שכבתיים נתמכים נוחים במיוחד למיקרוסקופיית אור ואלקטרונים, ומספקים גם זמן טוב יותר וגם רזולוציה מרחבית טובה יותר ממה שניתן להשיג לעתים קרובות בתאים. SLBs מעוקלים במיוחד מספקים אמצעי אטרקטיבי לבדיקת רגישות לעקמומיות חלבונים בהיעדר דפורמציה משמעותית של הממברנה, ומאפשרים להבחין בין חישת עקמומיות לבין אינדוקציה של עקמומיות, שלעתים קרובות בלתי אפשרי להפריד במערכות העומדות בפני עצמן.
ספטינים הם סוג של חלבוני שלד ציטוסקטליים היוצרים נימה הידועים ביכולתם להרכיב על ממברנות מעוקלות חיוביות 6,18,20. במהלך מחזור התא בשמרים, ספטינים מתקבצים לטבעת ועליהם להתארגן מחדש כדי ליצור את שעון החול ואת מבני הטבעת הכפולה הקשורים להופעת ניצנים וציטוקינסיס, בהתאמה21. בעוד שעבודה יפה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים משוכפל פלטינה כדי לצפות בארכיטקטורת ספטין בשלבים משתנים של מחזור התא22, צפייה במכלול ספטין לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיית אור בשמרים נתקלה ברזולוציה מרחבית מוגבלת. עבודה קודמת על ספטינים באמצעות מונו-שכבות ליפידים שהומחשה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) הצליחה לשחזר מספר מבני ספטין מעניינים כגון טבעות, צרורות וגאוזים23. עם זאת, טכניקות EM מוגבלות גם הן ברזולוציה הטמפורלית שלהן, בניגוד למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. על מנת לפתור טוב יותר את הפרמטרים הקינטיים של התהליך הרב-ממדי של הרכבת ספטין, פנינו לפנטומיסטיקות ממברנה נתמכות, שבהן ניתן לשלוט בזהירות בגיאומטריה של הממברנה, בתנאי הדגימה ובשיטת ההדמיה.
הפרוטוקולים המתוארים כאן משתמשים ב-SLBs מישוריים או מעוקלים, בחלבון מטוהר ובשילוב של טכניקות מיקרוסקופיה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית פלואורסצנטית כמותית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) שימשו למדידת קשירת חלבונים בתפזורת על עקמומיות ממברנה שונות, כמו גם למדידת הקינטיקה הקושרת של מולקולות בודדות. יתר על כן, פרוטוקול זה הותאם לשימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) כדי לבחון מבנה-על של חלבונים על עקמומיות ממברנה שונה. בעוד שהמיקוד של פרוטוקולים אלה הוא על שלד ספטין ציטוסקלטון, ניתן לשנות את הפרוטוקולים בקלות כדי לחקור את רגישות העקמומיות של כל חלבון שהקורא מוצא מעניין. בנוסף, אלה העובדים בתחומים כגון אנדוציטוזה או סחר בשלפוחית עשויים למצוא טכניקות אלה שימושיות לבדיקת מכלולים תלויי עקמומיות של קומפלקסים מרובי חלבונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
קרום התאים לובש צורות, עקמומיות ותכונות פיזיקוכימיות רבות ושונות. על מנת לחקור את המנגנונים בקנה מידה ננומטרי שדרכם תאים בונים מכלולים בקנה מידה של מיקרומטר, יש צורך לתכנן מערכות שחזור מינימליות של פנטומימה של ממברנות. פרוטוקול זה מציג טכניקות השולטות במדויק הן בעקמומיות הממברנה והן בהר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). R01 GM-130934 והקרן הלאומית למדע (NSF) מענק MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., ו- K.S.C. נתמכו בחלקם על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תחת הפרס T32 GM119999.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
