הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)
Summary
פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).
Abstract
באופן מסורתי, שלדי האקטין והמיקרוטובול נחקרו כישויות נפרדות, מוגבלים לאזורים או תהליכים תאיים ספציפיים, ומווסתים על ידי חבילות שונות של חלבונים קושרים ייחודיים לכל פולימר. מחקרים רבים מראים כיום כי הדינמיקה של שני הפולימרים הציטוסקטליים שלובים זה בזה, וכי הצלבה זו נדרשת עבור רוב ההתנהגויות התאית. מספר חלבונים המעורבים באינטראקציות אקטין-מיקרוטובול כבר זוהו (כלומר, טאו, MACF, GAS, פורמינים ועוד) והם מאופיינים היטב ביחס לאקטין או למיקרוטובולים בלבד. עם זאת, מחקרים מעטים יחסית הראו בדיקות של תיאום אקטין-מיקרוטובול עם גרסאות דינמיות של שני הפולימרים. זה עשוי לחסום מנגנוני קישור מתפתחים בין אקטין למיקרוטובולים. כאן, טכניקת שיקום מחדש של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המבוססת על מיקרוסקופיה במבחנה מאפשרת הדמיה של דינמיקה של אקטין ומיקרוטובולים הן מהתגובה הביוכימית האחת. טכניקה זו משמרת את דינמיקת הפילמור של חוט אקטין או מיקרוטובולים בנפרד או בנוכחות הפולימר האחר. חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו התנהגויות של אקטין-מיקרוטובולים משתנות בנוכחות חלבון קלאסי של קישור צולב של שלד ציטוסקטלי. שיטה זו יכולה לספק תובנות פונקציונליות ומכניסטיות מהימנות לגבי האופן שבו חלבונים רגולטוריים בודדים מתאמים דינמיקה של אקטין-מיקרוטובולים ברזולוציה של חוטים בודדים או קומפלקסים מסדר גבוה יותר.
Introduction
מבחינה היסטורית, אקטין ומיקרוטובולים נתפסו כישויות נפרדות, שלכל אחת מהן קבוצה משלה של חלבונים רגולטוריים, התנהגויות דינמיקה ומיקומים תאיים נפרדים. ראיות רבות מראות כיום כי אקטין ופולימרים של מיקרוטובולים עוסקים במנגנוני crosstalk פונקציונליים החיוניים לביצוע תהליכים תאיים רבים, כולל נדידה, מיקום ציר מיטוטי, הובלה תוך-תאית ומורפולוגיהשל תאים 1,2,3,4. ההתנהגויות המתואמות המגוונות העומדות בבסיס דוגמאות אלה תלויות באיזון מורכב של גורמי צימוד, אותות ותכונות פיזיקליות. עם זאת, הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס מנגנונים אלה עדיין אינם ידועים במידה רבה מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפולימר ציטוסקטלי יחיד בכל פעם 1,2,5.
אקטין ומיקרוטובולים אינם מתקשרים ישירות 6,7,8. הדינמיקה המתואמת של אקטין ומיקרוטובולים הנראים בתאים מתווכת על ידי גורמים נוספים. חלבונים רבים שנחשבו לווסתים את ההצלבה של אקטין-מיקרוטובול זוהו ופעילותם מאופיינת היטב ביחס לפולימר ציטוסקטלי בלבד 1,2. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שגישת פולימר יחיד זו הסתירה את הפונקציות הכפולות של חלק מהחלבונים/קומפלקסים המאפשרים אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול 7,8,9,10,11,12,13. ניסויים שבהם שני הפולימרים נוכחים הם נדירים ולעתים קרובות מגדירים מנגנונים עם פולימר דינמי יחיד וגרסה מיוצבת סטטית של 6,8,9,10,10,11,14,15,16,17,18 . לפיכך, יש צורך בשיטות כדי לחקור את התכונות המתפתחות של חלבונים מתאמי אקטין-מיקרוטובולים, שניתן להבין אותם במלואם רק במערכות ניסיוניות המשתמשות בשני הפולימרים הדינמיים.
השילוב של גישות לסימון חלבונים ישירים, תגי זיקה מקודדים גנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) יושם בהצלחה רבה במערכות שחזור ביומימטיות 19,20,21,22,23. תוכניות רבות מלמטה למעלה אינן מכילות את כל הגורמים המווסתים חלבונים בתאים. עם זאת, טכנולוגיית “ביוכימיה על כוסית” עידנה מנגנונים רבים של דינמיקת אקטין ומיקרוטובולים בקני מידה מרחביים וטמפורליים גבוהים, כולל הרכיבים הדרושים להרכבה או לפירוקשל פולימרים, ותנועת חלבונים מוטוריים 5,12,23,24,25,26,27 . כאן מתוארת גישה מינימלית של רכיב יחיד לחקר צימוד אקטין-מיקרוטובול במבחנה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים מטוהרים זמינים מסחרית או טהורים מאוד, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי, תאי פרפוזיה, ומורחבים לסכימות מסובכות יותר המכילות תמציות תאים או מערכות סינתטיות. כאן, חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו הדינמיקה של השלד הציטו-שלדי משתנה בנוכחות חלבון צימוד אקטין-מיקרוטובול, אך ניתן להחליף אותו בגורמים מתאמים אחרים של אקטין-מיקרוטובול. היתרון העיקרי של מערכת זו על פני גישות אחרות הוא היכולת לנטר בו זמנית את הדינמיקה של פולימרים ציטוסקטליים מרובים בתגובה אחת. פרוטוקול זה גם מספק למשתמשים דוגמאות וכלים פשוטים לכימות שינויים בפולימרים של שלדיים. לפיכך, משתמשי הפרוטוקול יפיקו נתונים אמינים, כמותיים, בעלי רזולוציה של נימה אחת, כדי לתאר מנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו חלבונים רגולטוריים מגוונים מתאמים את הדינמיקה של אקטין-מיקרוטובול.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) כדי לדמיין חלבונים מטוהרים היה גישה פורה ומשכנעת לנתח מנגנונים ייחודיים של ויסות ציטוסקטלי 5,23,24,25,26,27,35. בהשוואה למבחנים ביוכימיים מסורתיים, תגובות TIRF דורשות נפחים קטנים מאוד (50-100 μL), ומדידות כמותיות של דינמיקה ציטוסקטלית יכולות להילקח מבדיקה בודדת. רוב המחקרים על דינמיקה של שלד ציטוסקטלי מתמקדים במערכת פולימרית בודדת (כלומר, חוטי אקטין או מיקרוטובולים), ולכן מדידות מפורטות של ההצלבה או ההתנהגויות המתפתחות בין חוטי אקטין למיקרוטובולים הנראים בדרך כלל בתאים נותרו חמקמקות וקשות לשחזור במבחנה. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרוסקופיה TIRF בעלת נימה אחת המאפשרת הדמיה ישירה של אקטין דינמי ופולימרים מיקרוטובולים באותה תגובה ביוכימית. לפיכך, שיטה זו חורגת מעבר למבחנים מסורתיים המסכמים את ההתנהגות הדינמית של חוטי אקטין או מיקרוטובולים בלבד. טכניקה זו בוצעה גם עם טאו כדוגמה לאופן שבו מספר תכונות דינמיות משתנות בנוכחות גורם צימוד ציטוסקטון. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים נוספים הידועים או החשודים כמתאמים אקטין או דינמיקה של מיקרוטובולים, כולל (אך לא רק) MACF, GAS, פורמינים ועוד. לבסוף, ניתן להשתמש בניתוחים לדוגמה כמדריך לכימות נתונים שנרכשו באמצעות פרוטוקול זה.
“לראות זה להאמין” היא סיבה משכנעת לבצע בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה. עם זאת, נדרשת זהירות בביצוע ובפענוח של ניסויי מיקרוסקופיה של TIRF. אחד האתגרים הגדולים של מבחני הרכבה משותפת של ציטוסקטליים הוא שתנאי הדמיה נפוצים רבים אינם תואמים כל פולימר. למיקרוטובולים ולאקטין יש בדרך כלל דרישות שונות של מאגר, טמפרטורה, מלח, נוקלאוטיד וריכוז לפולימריזציה. אקטין, טובולין, חלבונים רגולטוריים בעלי עניין, והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה רגישים למחזורי הקפאה-הפשרה. לכן, טיפול זהיר בחלבונים ובמאגרים נחוץ כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. כדי להפיג רבים מהחששות הללו, מומלץ מאוד להשתמש בטובולין ממוחזר טרי (קפוא למשך <6 שבועות), ולפנות מראש אקטינים קפואים/מוחזרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. שיקולים אלה חלים גם על שלל החלבונים הרגולטוריים שיש להעריך בהליך זה, אשר עשויים להיות רגישים למחזורי הפשרה בהקפאה או לריכוז מלחי החיץ 5,11,36.
למרבה הצער, לא קיים מאגר אחד שמתאים לכולם ללא פשרות ניסיוניות. כדי להתאים נפח גדול יותר לחלבונים בעלי ריכוז נמוך יותר, ATP ו-GTP עשויים להיכלל בתמיסת המאגר 2x TIRF (איור 1C). עם זאת, מכיוון שהנוקלאוטידים האלה רגישים מאוד למחזורי הפשרה בהקפאה, זה לא מומלץ. תרכובות טיהור החמצן המשמשות כאן (כלומר, קטלאז וגלוקוז-אוקסידאז) נחוצות כדי להמחיש חלבונים לפרקי זמן ארוכים (דקות עד שעות), אך ידוע שהן מגבילות פילמור מיקרוטובולים בריכוזים גבוהים5. בהקשר לשיקולי מאגר אלה, מגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק מהחלבונים הרגולטוריים הקשורים למיקרוטובולים קנוניים עשויים לדרוש פחות או יותר מלח כדי לשחזר פונקציות שנמצאות בתאים או במבחנים באמצעות מיקרוטובולים בלבד (ללא אקטין). שינוי האופי או הריכוז של המלח כדי לתת מענה לחששות אלה ישפיע ככל הנראה על שיעורי פילמור נימה של אקטין ו/או פרמטרים של דינמיקה של מיקרוטובולים. מדידות של פרמטרים תיאוריים מרובים (מינימלי, נוקלאציה, קצב התארכות ויציבות) (איור 3) נדרשות כדי לאשר את הצלחת הפרוטוקול או לתעד במפורש את ההשפעות של מאגרים ספציפיים או חלבונים רגולטוריים. לדוגמה, יותר מדי פולימריזציה של חוטי אקטין יכולה לטשטש אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול תוך שניות. כתוצאה מכך, כוונון עדין של תנאי הניסוי על ידי הפחתת הריכוז הכולל של אקטין או הכללת חלבונים נוספים לדיכוי גרעין אקטין (כלומר, פרופילין) יאריך את התקופה הכוללת שבה ניתן לראות בבירור פעילויות אקטין-מיקרוטובול מתואמות. פקדים המתייחסים לתנאים מוקדמים אלה, ושכפולים טכניים (מעבר לשדות תצוגה מרובים), הם קריטיים עבור משתמשים כדי ליצור תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור.
מחקרים מבוססי תאים מספקים הזדמנות מוגבלת לבחון יחסי חלבון-חלבון ישירים או את פעולתם של קומפלקסים רגולטוריים. לעומת זאת, חלק מהמנגנונים שנלקחו ממבחני מבחנה לא תמיד משקפים את ההתנהגויות המדויקות של חלבונים הנראים בתאים. ניתן לטפל בדילמה ביוכימאית קלאסית זו ביישומים עתידיים של טכניקה זו עם שינויים ספציפיים. לדוגמה, הוספת חלבוני צימוד פונקציונליים בעלי תווית פלואורסצנטית מרחיבה את השיטה הזו ממחקרים בעלי נימה בודדת למחקרים של מולקולה אחת. ניתן לשנות עוד יותר את הבדיקות כדי להשתמש בתמציות תאים שעשויות להוסיף את גורמי המפתח הלא ידועים “החסרים” הנדרשים כדי לשחזר תופעות דמויות תאים. לדוגמה, לבדיקות מבוססות TIRF המשתמשות בתמציות שמרים או קסנופוס יש טבעות אקטומיוזין מתכווצות37, צירים מיטוטיים 26,38, רכיבים של מכלול אקטין או מיקרוטובול39,40, ואפילו דינמיקה בסנטרוזום ובקינטוכורים 36,41,42,43 . יתר על כן, מערכות כאלה עשויות לסלול את הדרך למערכות תאים מלאכותיות שיש להן ליפידים או גורמי איתות המציגים 44,45,46.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני אסיר תודה למארק רידילה (תיקון ביוטכנולוגיה) ובריאן הארר (SUNY Upstate) על הערות מועילות על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM133485).
Materials
| 1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
| 1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
| 10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
| 100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
| 120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
| 24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
| 37 oC heatblock | |||
| 37 oC water bath | |||
| 5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
| 5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
| 50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
| 70 oC incubator | |||
| Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
| Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
| Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
| Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
| Dry ice | |||
| FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
| Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
| Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
| HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
| Ice | |||
| Ice bucket | |||
| Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
| iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
| LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
| Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
| mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
| Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
| Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
| Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
| SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
| Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| Spectrophotometer | |||
| Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
| Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
| Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
| Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |
References
- Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
- Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
- Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
- Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
- Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004 (2016).
- Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
- Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
- Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
- Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
- Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916 (2021).
- Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
- Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
- Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
- Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
- Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119 (2022).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
- Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
- Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
- Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520 (2019).
- King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270 (2020).
- Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB’s tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
- Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008 (2013).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
- Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794 (2019).
- Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
- Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177 (2020).
- Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
- Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
- Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
- Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
- Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386 (2018).
- Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
- Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
- Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433 (2014).
- Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212 (2022).
- Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).
