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Biochemistry

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/64074
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology,State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

Summary

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Abstract

Traditionnellement, les cytosquelettes d’actine et de microtubules ont été étudiés en tant qu’entités distinctes, limitées à des régions ou des processus cellulaires spécifiques et régulées par différentes suites de protéines de liaison uniques pour chaque polymère. De nombreuses études démontrent maintenant que la dynamique des deux polymères cytosquelettiques est entrelacée et que cette diaphonie est nécessaire pour la plupart des comportements cellulaires. Un certain nombre de protéines impliquées dans les interactions actine-microtubule ont déjà été identifiées (c.-à-d. Tau, MACF, GAS, formines, etc.) et sont bien caractérisées en ce qui concerne l’actine ou les microtubules seuls. Cependant, relativement peu d’études ont montré des tests de coordination actine-microtubule avec des versions dynamiques des deux polymères. Cela peut entraîner des mécanismes de liaison émergents entre l’actine et les microtubules. Ici, une technique de reconstitution in vitro basée sur la microscopie par fluorescence interne totale (TIRF) permet de visualiser à la fois la dynamique de l’actine et des microtubules à partir d’une seule réaction biochimique. Cette technique préserve la dynamique de polymérisation du filament d’actine ou des microtubules individuellement ou en présence de l’autre polymère. La protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment les comportements actine-microtubule changent en présence d’une protéine de réticulation cytosquelettique classique. Cette méthode peut fournir des informations fonctionnelles et mécanistes fiables sur la façon dont les protéines régulatrices individuelles coordonnent la dynamique actine-microtubule à une résolution de filaments uniques ou de complexes d’ordre supérieur.

Introduction

Historiquement, l’actine et les microtubules ont été considérés comme des entités distinctes, chacune avec son propre ensemble de protéines régulatrices, de comportements dynamiques et d’emplacements cellulaires distincts. De nombreuses preuves démontrent maintenant que les polymères d’actine et de microtubules s’engagent dans des mécanismes de diaphonie fonctionnels qui sont essentiels à l’exécution de nombreux processus cellulaires, notamment la migration, le positionnement du fuseau mitotique, le transport intracellulaire et la morphologie cellulaire 1,2,3,4. Les divers comportements coordonnés qui sous-tendent ces exemples dépendent d’un équilibre complexe de facteurs de couplage, de signaux et de propriétés physiques. Cependant, les détails moléculaires qui sous-tendent ces mécanismes sont encore largement inconnus car la plupart des études se concentrent sur un seul polymère cytosquelettique à la fois 1,2,5.

L’actine et les microtubules n’interagissent pas directement 6,7,8. La dynamique coordonnée de l’actine et des microtubules observée dans les cellules est médiée par d’autres facteurs. De nombreuses protéines censées réguler la diaphonie actine-microtubule ont été identifiées et leurs activités sont bien caractérisées en ce qui concerne l’un ou l’autre polymère cytosquelettique seul 1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que cette approche à polymère unique a dissimulé les doubles fonctions de certaines des protéines / complexes qui permettent les événements de couplage actine-microtubule 7,8,9,10,11,12,13. Les expériences où les deux polymères sont présents sont rares et définissent souvent des mécanismes avec un seul polymère dynamique et une version stabilisée statique de l’autre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Ainsi, des méthodes sont nécessaires pour étudier les propriétés émergentes des protéines de coordination actine-microtubule qui ne peuvent être pleinement comprises que dans les systèmes expérimentaux qui utilisent les deux polymères dynamiques.

La combinaison d’approches de marquage direct des protéines, de marqueurs d’affinité génétiquement codés et de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a été appliquée avec beaucoup de succès dans les systèmes de reconstitution biomimétique 19,20,21,22,23. De nombreux schémas ascendants ne contiennent pas tous les facteurs qui régulent les protéines dans les cellules. Cependant, la technologie de la « biochimie sur un verre de couverture » a affiné de nombreux mécanismes de la dynamique de l’actine et des microtubules à des échelles spatiales et temporelles élevées, y compris les composants nécessaires à l’assemblage ou au démontage des polymères et au mouvement des protéines motrices 5,12,23,24,25,26,27 . Ici, une approche monofila filamenteuse à composant minimal pour étudier le couplage actine-microtubule in vitro est décrite. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines purifiées disponibles dans le commerce ou très pures, des protéines marquées par fluorescence, des chambres de perfusion, et étendu à des schémas plus complexes contenant des extraits de cellules ou des systèmes synthétiques. Ici, la protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment la dynamique du cytosquelette change en présence d’une protéine de couplage actine-microtubule, mais peut être substituée à d’autres facteurs de coordination actine-microtubule putatifs. L’avantage majeur de ce système par rapport à d’autres approches est la possibilité de surveiller simultanément la dynamique de plusieurs polymères cytosquelettiques en une seule réaction. Ce protocole fournit également aux utilisateurs des exemples et des outils simples pour quantifier les changements dans les polymères cytosquelettiques. Ainsi, les utilisateurs du protocole produiront des données fiables, quantitatives et de résolution d’un seul filament pour décrire les mécanismes qui sous-tendent la façon dont diverses protéines régulatrices coordonnent la dynamique actine-microtubule.

Protocol

1. Laver les couvercles REMARQUE: Laver (24 mm x 60 mm, # 1.5) les couvercles selon Smith et al., 201328. Disposez les couvercles dans un conteneur de courrier coulissant en plastique. Immerger les couvercles séquentiellement dans les solutions suivantes et soniquer pendant 30-60 min, rincer avec du ddH2O 10 fois entre chaque solution: ddH2O avec une goutte de savon à vaisselle; 0,1 M KOH. Conservez les couvercles dans de l’éthanol à 100% jusqu’à 6 mois.REMARQUE: Ne touchez pas les surfaces en verre avec des doigts mal aimés. Utilisez plutôt des pinces. 2. Revêtement nettoyé (24 mm x 60 mm, #1.5) recouvrant les lèvres avec du mPEG et de la biotine-PEG-silane REMARQUE: Ce protocole utilise spécifiquement un système biotine-streptavidine pour positionner l’actine et les microtubules dans le plan d’imagerie DU FRBR. D’autres revêtements et systèmes peuvent être utilisés (p. ex. anticorps, poly-L-lysine, myosine NEM, etc.). Décongeler les aliquotes de poudres de PEG-silane et de biotine-PEG-silane. Dissoudre les poudres de PEG dans de l’éthanol à 80 % (pH 2,0) pour générer des solutions mères de revêtement de 10 mg/mL mPEG-silane et 2-4 mg/mL de biotine-PEG-silane, juste avant l’utilisation.REMARQUE: Les poudres de PEG semblent souvent dissoutes, mais peuvent ne pas être au niveau microscopique. Une remise en suspension appropriée prend environ 1 à 2 minutes avec un pipetage constant. Les utilisateurs sont encouragés à pipeter 10 fois de plus après l’apparition de la dissolution de la poudre.ATTENTION : Portez des gants pour protéger la peau du HCl concentré lorsque vous produisez de l’éthanol à 80 % (pH 2,0). Retirez le couvercle propre (24 mm x 60 mm, #1.5) du couvercle du stockage de l’éthanol à l’aide d’une pince. Sécher avec de l’azote gazeux et conserver dans une boîte de Pétri propre. Revêtements de couche avec 100 μL de solution de revêtement: un mélange de 2 mg/mL de mPEG-silane (MW 2 000) et de 0,04 mg/mL de biotine-PEG-silane (MW 3 400) dans de l’éthanol à 80 % (pH 2,0).REMARQUE: Pour un revêtement clairsemé (recommandé), utilisez 2 mg / mL mPEG-silane et 0,04 mg / mL de biotine-PEG-silane. Pour un revêtement dense, utilisez 2 mg/mL mPEG-silane, 4 mg/mL de biotine-PEG-silane. Incuber les couvercles à 70 °C pendant au moins 18 h ou jusqu’à utilisation.REMARQUE: Les couvercles enduits se dégradent s’ils sont conservés à 70 ° C pendant plus de 2 semaines. 3. Assemblage des chambres d’écoulement d’imagerie Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à double dos sur une longueur de 24 mm. Retirez un côté du support de bande et fixez des morceaux de ruban adhésif adjacents aux six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre.REMARQUE: Le ruban doit être plat pour un assemblage correct, sinon les chambres d’imagerie fuiront. Retirez soigneusement le support de bande pour éviter les chocs. Il est recommandé de faire glisser des chambres scotchées sur une surface propre pour lisser les contacts de la chambre à ruban adhésif. Retirez le deuxième morceau de support de bande pour exposer le côté collant de la bande le long de chaque rainure de chambre. Placez le ruban adhésif de la chambre vers le haut sur une surface propre. Mélanger la résine époxy et les solutions de durcisseur 1:1 (ou selon les instructions du fabricant) dans un petit bateau de pesage. Utilisez une pointe P1000 pour placer une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie (flèche rouge; Figure 1A). Placez le ruban adhésif de la chambre/côté époxy vers le haut sur une surface propre. Retirez un couvercle enduit de l’incubateur à 70 °C. Rincez six fois les surfaces revêtues et non revêtues des couvercles avec du ddH2O, séchez-les avec de l’azote gazeux filtré, puis fixez-les à la chambre d’imagerie avec le côté du revêtement de couvercle vers le ruban adhésif. Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface ruban-verre afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban et le couvercle.REMARQUE: Avec un joint approprié, le ruban adhésif double face devient translucide. Les chambres d’imagerie dépourvues de contacts de chambre à bande suffisants fuiront. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins 5 à 10 minutes pour permettre à l’époxy de sceller complètement les puits de la chambre avant utilisation. Les chambres de perfusion expirent dans les 12-18 heures suivant l’assemblage.REMARQUE: Selon le placement du ruban et l’épaisseur du ruban adhésif double face utilisé, la chambre assemblée aura un volume final de 20 à 50 μL. 4. Conditionnement des chambres de perfusion Utilisez une pompe de perfusion (débit réglé à 500 μL/min) pour échanger séquentiellement des solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion comme suit : Débit de 50 μL de 1 % de BSA pour amorcer la chambre d’imagerie. Retirez l’excès de tampon du réservoir de raccord de verrouillage Luer. Débit 50 μL de 0,005 mg/mL de streptavidine. Incuber pendant 1-2 min à température ambiante. Retirez l’excès de tampon du réservoir. Débit de 50 μL de 1 % de BSA pour bloquer la liaison non spécifique. Incuber pendant 10-30 s. Retirez l’excès de tampon du réservoir. Débit 50 μL de tampon CHAUD (37 °C) 1x TAMPON TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM TNT, 40 mM de glucose, 0,25 % (v/v) méthylcellulose (4 000 cp)).REMARQUE: Ne retirez pas l’excès de tampon du réservoir. Cela empêche la chambre de se dessécher, ce qui peut introduire des bulles d’air dans le système. Facultatif : Débit de 50 μL de graines de microtubules biotinylées stabilisées à29 et 50 % diluées dans 1x tampon TIRF.REMARQUE: La dilution appropriée doit être déterminée empiriquement et contenir une variabilité d’un lot à l’autre. Les protocoles de27,29 sont recommandés comme points de départ. Une dilution donnant 10 à 30 graines par champ de vision fonctionne bien avec cette configuration. 5. Préparation au microscope REMARQUE: Les réactions biochimiques contenant des filaments d’actine dynamiques et des microtubules sont visualisées / effectuées à l’aide d’un microscope TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) inversé équipé de lasers à semi-conducteurs de 120 à 150 mW, d’un objectif TIRF à immersion dans l’huile 63x corrigé de la température et d’une caméra EMCCD. Les protéines de cet exemple sont visualisées aux longueurs d’onde suivantes : 488 nm (microtubules) et 647 nm (actine). Réglez le dispositif de chauffage de la scène/de l’objectif pour maintenir 35-37 °C au moins 30 minutes avant l’imagerie de la première réaction biochimique. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme suit : Réglez l’intervalle d’acquisition à toutes les 5 heures pendant 15 à 20 minutes. Réglez les expositions laser 488 et 647 à 50-100 ms à 5% -10% de puissance. Définissez l’angle TIRF approprié pour le microscope.REMARQUE: Quelle que soit la configuration du microscope, le moyen le plus simple de régler la puissance du laser, l’exposition et l’angle TIRF consiste à effectuer des ajustements sur les images de l’un ou l’autre polymère seul (voir 5.2.2.1 et 5.2.2.2, ci-dessous). Les utilisateurs sont fortement encouragés à utiliser les paramètres de puissance et d’exposition laser les plus bas qui permettent encore la détection. Ajuster la réaction de polymérisation (Figure 1C) pour initier l’assemblage du filament d’actine et acquérir des images à 647 nm. Faites les ajustements appropriés. Ajuster la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné pour initier l’assemblage des microtubules (Figure 1C) et visualiser à 488 nm. Faites les ajustements appropriés. 6. Préparation de mélanges de réactions protéiques Préparer une solution mère de tubuline marquée par fluorescence. Déterminer la concentration de tubuline maison non marquée par spectrophotométrie à Abs280, comme suit: Spectrophotomètre vierge avec 1xBRB80 manquant de GTP. Calculer la concentration de tubuline en utilisant le coefficient d’extinction déterminé de 115 000 M-1 cm-1 et la formule suivante : Remettre en suspension de la tubuline 488-tubuline lyophilisée lyophilisée fabriquée commercialement à 10 μM (1 mg/mL; étiquette à 100 %) avec 20 μL de 1x BRB80 sans GTP. Décongeler une aliquote de 7,2 μL de 100 μM de tubuline recyclée29 non étiquetée sur de la glace.REMARQUE: La tubuline recyclée est essentielle à la réussite de l’assemblage de microtubules in vitro, car elle élimine les dimères incompétents de polymérisation formés dans les stocks de protéines congelées29,30. Mélanger 3 μL de 10 μM de 488-tubuline avec l’aliquote de 7,2 μL de 100 μM de tubuline non marquée, pas plus de 15 min avant utilisation. Préparer la solution mère d’actine marquée par fluorescence. Pour les protéines faites maison, déterminez la concentration et l’étiquette de pourcentage d’actine par spectrophotométrie Abs290 et Abs650, comme suit: Spectrophotomètre vierge avec tampon G. Calculer la concentration d’actine non marquée en utilisant le coefficient d’extinction déterminé de 25 974 M-1 cm-1 et la formule suivante : Calculer la concentration de lysine marquée Alexa-647-actine en utilisant le coefficient d’extinction de l’actine non marquée, le facteur de correction du fluor de 0,03 et la formule suivante :[Alexa-647 actine], μM = (Abs290 – Calculez l’étiquette en pourcentage d’Alexa-647-actine en utilisant la ε déterminée pour Alexa-647 de 239 000 M-1 cm-1, comme suit :% d’étiquette d’Alexa-647-actine = (Abs290 – ( Décongeler une aliquote de 2 μL de 3 μM 100 % de biotine-actine marquée (marquée sur les résidus de lysine). Diluer 10 fois en ajoutant 18 μL de tampon G. Combiner 3 μL d’actine biotinylée diluée, des volumes appropriés d’actine non marquée et marquée (ci-dessus) de sorte que le mélange final soit de 12,5 μM d’actine totale avec une étiquette fluorescente de 10 % à 30 %.REMARQUE: Plus de 30% de monomères d’actine fluorescents (final) peuvent compromettre la résolution d’imagerie car les filaments deviennent difficiles à discerner de l’arrière-plan. Préparer des mélanges de réaction (Figure 1C). Préparer le mélange de cytosquelette (tube A) en combinant 2 μL du mélange d’actine de 12,5 μM (6.2.3) avec le mélange de tubuline (6.1.4), au plus tard 15 minutes avant l’imagerie. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Préparer un mélange de réaction protéique (tube B) en combinant tous les autres composants expérimentaux et protéines, y compris: 2x tampon TIRF, anti-eau de Javel, nucléotides, tampons et protéines accessoires. Un exemple est illustré à la figure 1C.REMARQUE: La dilution finale donne un tampon TIRF 1x qui contient de l’ATP, du GTP et de la force ionique dans la plage physiologique estimée. Incuber le tube A et le tube B séparément à 37 °C pendant 30 à 60 s. Pour déclencher la réaction, mélanger et ajouter le contenu du tube B au tube A (ci-dessous). 7. Image de l’actine et dynamique des microtubules Bien de perfusion (Figure 1B; étape 4, ci-dessus). Initier l’assemblage simultanément de l’actine et du microtubule en ajoutant le contenu du tube B (mélange réactionnel) au tube A (mélange de cytosquelettes) (Figure 1C). Débit de 50 μL de réaction contenant 1x tampon TIRF complété par 15 μM de tubuline libre, 1 mM GTP et 0,5 μM de monomères d’actine et des volumes appropriés de contrôles tampons. Enregistrez un film en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope pour acquérir toutes les 5 s pendant 15 à 20 minutes.REMARQUE: L’amorçage de la dynamique de l’actine et des microtubules se produit dans les 2 à 5 minutes (Figure 2). Des délais plus longs indiquent des problèmes de contrôle de la température ou des problèmes liés à la concentration de protéines dans le mélange réactionnel. Conditionner un nouveau puits de perfusion (étape 4) et remplacer le volume tampon par des protéines régulatrices d’intérêt (c.-à-d. Tau) et des témoins tampons (figure 1C). Acquérir comme indiqué à l’étape 7 (ci-dessus) pour évaluer les protéines régulatrices pour les fonctions émergentes actine-microtubule. 8. Traiter et analyser des images à l’aide du logiciel FIJI31 Ouvrez les films TIRF enregistrés et affichez-les en tant que composite. Analyser la dynamique des microtubules (Figure 3A), comme suit : Générez une projection Z maximale basée sur le temps à partir du menu piles d’images. Synchronisez la fenêtre de projection Z avec le film TIRF d’origine à partir du menu Analyser> Outils> Synchroniser Windows . Tracez une ligne à l’aide de l’outil en ligne droite le long d’un microtubule d’intérêt sur l’image projetée dans le temps. Ouvrez le gestionnaire de région d’intérêt (ROI) à partir du menu Analyser (Analyser> Outils> Gestionnaire de retour sur investissement). Enregistrez les emplacements individuels des microtubules en appuyant sur « t ». Répétez l’opération pour tous les microtubules d’intérêt. Tracez les kymographes des lignes sélectionnées à l’aide de « / » ou exécutez la macro multi-kymo qui génère une vidéo et un kymographe pour chaque microtubule dans le gestionnaire de retour sur investissement31. Ajoutez des barres d’échelle de longueur (μm) et de temps (min) aux kymographes à partir du menu Analyser> Outils> Barres d’échelle . Mesurer les vitesses de croissance des microtubules à partir des pentes du kymographe (Figure 3A, 1-2; pente des lignes noires). Compter les événements de microtubules dynamiques (catastrophe ou repousse) à partir du kymographe généré ou à l’aide des macros d’analyse disponibles 5,8,18,25. Les lignes pointillées rouges de la figure 3A, 1 à 2 représentent des catastrophes ou des événements de démontage rapide. Analyser la dynamique de l’actine (figure 3B), comme suit : Mesurer la nucléation de l’actine, comme suit : Compter le nombre de filaments d’actine présents dans le champ de vision 100 s après le début de la réaction et exprimer par la zone (filaments par μm2). Enregistrez et enregistrez les données dans le gestionnaire de retour sur investissement, comme à l’étape 8.2.3.1 ci-dessus. Mesurer les taux d’allongement des filaments d’actine (figure 3B), comme suit : Tracez une ligne le long d’un filament d’actine d’intérêt à l’aide de l’outil de ligne segmentée. Ajoutez une ligne au gestionnaire de retour sur investissement comme à l’étape 8.2.3.1 ci-dessus. Répétez l’opération en suivant la ligne (en ajoutant chaque mesure au gestionnaire de retour sur investissement) pour au moins quatre images vidéo.REMARQUE: Il est recommandé de mesurer sept à huit images consécutives, mais certaines conditions ralentissent la polymérisation de l’actine en dessous de la limite détectable qui peut être résolue par des configurations d’objectif / microscope. Dans un tel cas, des mesures peuvent être effectuées à intervalles réguliers sur des images non consécutives (par exemple, toutes les cinq images). Tracez les valeurs de longueur mesurées sur le temps écoulé. La pente de la ligne générée est le taux d’allongement de l’actine en microns/s. Transmettre les débits finaux calculés sous forme de sous-unités s-1 μM-1 en utilisant un facteur de correction de 370 sous-unités pour tenir compte du nombre de monomères d’actine dans un micron de filament32. Effectuer une analyse corrélative pour les régions d’association parallèle actine-microtubule (Figure 3C), comme suit : Tracez une ligne le long d’un microtubule d’intérêt à un moment précis (c.-à-d. 300 s après le début de la réaction), à l’aide de l’outil en ligne droite. Ajoutez une ligne au gestionnaire de retour sur investissement comme à l’étape 8.2.3.1 ci-dessus. Tracez l’intensité de fluorescence le long de la ligne dans chaque canal. Sélectionnez chaque canal avec le curseur d’image et tracez les intensités le long de la ligne à l’aide de la « commande k ». Enregistrez ou exportez des valeurs en cliquant sur le bouton « liste » dans la fenêtre de sortie. Exprimer les événements de couplage actine-microtubule sous forme de rapport (chevauchement de l’actine avec des microtubules) à partir d’événements individuels ou en tant que nombre d’événements dans un champ de vision donné à un point temporel cohérent (Figure 3C). Alternative: Utilisez un logiciel pour déterminer le pourcentage de chevauchement des deux canaux 5,12.

Representative Results

Dans les conditions décrites ci-dessus (Figure 1), les polymères d’actine et de microtubules doivent être visibles (et dynamiques) dans les 2 minutes suivant l’acquisition de l’image (Figure 2). Comme pour tout protocole basé sur la biochimie, une optimisation peut être nécessaire pour différentes protéines régulatrices ou lots de protéines. Pour ces raisons, l’angle TIRF et les expositions d’image sont définis en premier avec des réactions contenant chaque polymère individuel. Cela confirme que les protéines stockées sont fonctionnelles et qu’une quantité suffisante de protéines marquées est présente pour la détection. Bien qu’il ne soit pas toujours nécessaire (et non effectué ici), le post-traitement des films (c’est-à-dire la soustraction d’arrière-plan, la moyenne ou les transformations de Fourier) peut être utilisé pour améliorer le contraste de l’image (en particulier des microtubules)5,25,33. La visualisation directe des filaments d’actine simples et des microtubules offerte par ce test permet de déterminer quantitativement plusieurs mesures dynamiques pour l’un ou l’autre composant du cytosquelette seul ou ensemble, y compris les paramètres de polymérisation (c.-à-d. la vitesse de nucléation ou d’allongement), les paramètres de désassemblage (c.-à-d. les taux de retrait ou les catastrophes) et le coalignage/chevauchement des polymères (figure 3). ). De plus, ces mesures peuvent servir de point de départ pour déchiffrer la liaison ou l’influence de ligands régulateurs comme Tau (Figure 3). De nombreuses mesures de filaments d’actine simples ou de microtubules peuvent être effectuées à partir d’un seul film TIRF. Cependant, en raison des variations dans le revêtement de couverture, le pipetage et d’autres facteurs, des mesures fiables devraient également inclure de multiples réactions / films de réplication technique. De nombreuses facettes de la dynamique des microtubules peuvent être déterminées à partir d’exemples de kymographes, y compris le taux d’allongement des microtubules, ainsi que la fréquence des catastrophes et des événements de sauvetage (Figure 3A). L’utilisation de kymographes pour mesurer la dynamique de l’actine dans ce système n’est pas aussi simple car les filaments d’actine sont plus alambiqués que les microtubules. En conséquence, les paramètres de la dynamique des filaments d’actine sont mesurés à la main, ce qui prend du temps et demande beaucoup de travail. Les numérations sont mesurées comme le nombre de filaments d’actine présents à un point temporel cohérent pour toutes les conditions. Ces comptes varient considérablement d’un domaine d’imagerie TIRF à l’autre, mais peuvent être utilisés avec de nombreux réplicats ou pour compléter les observations d’autres essais de polymérisation. Les numérations de nucléation peuvent également être utilisées pour les microtubules si les conditions d’essai manquent de graines de microtubules stabilisées. Les taux d’allongement du filament d’actine sont mesurés comme la longueur du filament au fil du temps à partir d’au moins quatre images de film. Les valeurs de vitesse sont transmises par actine micromolaire avec un facteur de correction de 370 sous-unités pour tenir compte du nombre de monomères d’actine dans un micron de filament (Figure 3B)32. Les mesures permettant de définir les comportements coordonnés entre l’actine et les microtubules sont moins bien définies. Cependant, des analyses corrélatives ont été appliquées pour mesurer la coïncidence des deux polymères, y compris les balayages linéaires (Figure 3C) ou les logiciels de chevauchement 5,11,34. Disponibilité des données :Tous les ensembles de données associés à ce travail ont été déposés dans Zenodo et sont disponibles sur demande raisonnable à l’adresse suivante: 10.5281 / zenodo.6368327. Graphique 1. Schémas expérimentaux : assemblage de la chambre d’écoulement à l’acquisition d’images. (A) Assemblage de la chambre d’imagerie. De haut en bas : les chambres d’imagerie IBIDI sont scotchées le long des puits de perfusion (désignés par une flèche) ; la deuxième couche (blanche) de support de bande (laissée sur l’image montrée pour mieux orienter les utilisateurs) est retirée et l’époxy est appliqué au bord de la chambre de perfusion (flèche). Remarque: Pour orienter plus facilement les utilisateurs où placer l’époxy, le support blanc a été laissé sur cette image. Le couvercle nettoyé et revêtu est fixé à la chambre d’imagerie avec le côté revêtement orienté vers l’intérieur du puits de perfusion. (B) Organigramme illustrant les étapes du conditionnement des chambres d’imagerie pour les liaisons biotine-streptavidine. C) Exemples de réactions utilisées pour acquérir des films TIRF de microtubules dynamiques et de filaments d’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 2. Séquences d’images de filaments d’actine et de microtubules en croissance en l’absence ou en présence de Tau. Montage d’images en accéléré à partir de tests TIRF contenant 0,5 μM d’actine (10 % d’Alexa-647-actine et 0,09 % de biotine-actine marquée) et 15 μM de tubuline libre (4 % marquée HiLyte-488) en l’absence (A) ou en présence (B) de 250 nM Tau. Le temps écoulé depuis l’amorçage de la réaction (mélange du tube A et du tube B) est indiqué. Barres d’échelle, 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 3. Exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine. (A) La projection temporelle moyenne du canal de tubuline permet de visualiser efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer des diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes de microtubules dynamiques représentés à droite. Les phases de croissance (lignes noires pleines) et de démontage (lignes roses pointillées; deux signalées par des flèches roses) des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Barre d’échelle de temps, 3 min. Barre d’échelle de longueur, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal de la tubuline est affiché. (B) Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments à actine unique polymérisés activement. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des placettes de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire. Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué aux réactions d’actine de 0,5 μM pour comparaison des taux généralement déterminés à la concentration d’actine de 1 μM. Des exemples de cinq filaments sont montrés à droite. Barres d’échelle, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal d’actine est affiché. C) Images TIRF de microtubules dynamiques (MT) (vert) et de filaments d’actine (violet) polymérisés en l’absence (à gauche) ou en présence de 250 nM Tau (au milieu). Des lignes pointillées bleues et des flèches marquent l’endroit où une ligne a été tracée pour les tracés de balayage de ligne correspondant à chaque condition (sous chaque image). Le chevauchement entre les microtubules et les régions d’actine (en noir) peut être noté à un point de temps défini par zone (à droite). Barres d’échelle, 25 μm. Les réactions contiennent 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte) avec ou sans 250 nM De Tau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’utilisation de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser des protéines purifiées a été une approche fructueuse et convaincante pour disséquer des mécanismes uniques de régulation du cytosquelette 5,23,24,25,26,27,35. Par rapport aux essais biochimiques traditionnels, les réactions TIRF nécessitent de très petits volumes (50-100 μL), et des mesures quantitatives de la dynamique du cytosquelette peuvent être glanées à partir d’un essai individuel. La plupart des études sur la dynamique du cytosquelette se concentrent sur un seul système polymère (c’est-à-dire les filaments d’actine ou les microtubules), de sorte que les mesures détaillées de la diaphonie ou des comportements émergents entre les filaments d’actine et les microtubules généralement observés dans les cellules sont restées insaisissables et difficiles à récapituler dans le tube à essai. Pour résoudre ce problème, ce protocole décrit un système de microscopie TIRF à filament unique qui permet la visualisation directe d’actine dynamique et de polymères de microtubules dans la même réaction biochimique. Ainsi, cette méthode va au-delà des essais traditionnels qui récapitulent le comportement dynamique des filaments d’actine ou des microtubules seuls. Cette technique a également été réalisée avec Tau comme exemple de la façon dont plusieurs propriétés dynamiques changent en présence d’un facteur de couplage du cytosquelette. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines supplémentaires connues ou soupçonnées de coordonner la dynamique de l’actine ou des microtubules, y compris (mais sans s’y limiter) MACF, GAS, formines, etc. Enfin, les exemples d’analyses fournis peuvent être utilisés comme guide pour quantifier les données acquises avec ce protocole.

« Voir, c’est croire » est une raison impérieuse d’effectuer des tests basés sur la microscopie. Toutefois, la prudence est de mise dans l’exécution et l’interprétation des expériences de microscopie de la FRBR. L’un des principaux défis des tests de co-assemblage du cytosquelette est que de nombreuses conditions d’imagerie couramment utilisées ne sont pas compatibles avec chaque polymère. Les microtubules et l’actine ont généralement des exigences différentes en matière de tampon, de température, de sel, de nucléotide et de concentration pour la polymérisation. L’actine, la tubuline, les protéines régulatrices d’intérêt et les tampons utilisés dans ce protocole sont sensibles aux cycles de gel-dégel. Par conséquent, une manipulation prudente des protéines et des tampons est nécessaire pour exécuter avec succès ce protocole. Pour atténuer bon nombre de ces préoccupations, il est fortement recommandé d’utiliser de la tubuline fraîchement recyclée (congelée pendant <6 semaines) et de pré-éliminer les actines congelées/remises en suspension par ultracentrifugation. Ces considérations s’appliquent également à la myriade de protéines régulatrices à évaluer avec cette procédure, qui peuvent être sensibles aux cycles de gel-dégel ou à la concentration de sels tampons 5,11,36.

Malheureusement, il n’existe pas de tampon unique sans compromis expérimentaux. Pour s’approprier plus de volume pour les protéines de concentration plus faible, l’ATP et le GTP peuvent être inclus dans la solution tampon 2x TIRF (figure 1C). Cependant, comme ces nucléotides sont extrêmement sensibles aux cycles de gel-dégel, il n’est pas recommandé. Les composés piégeurs d’oxygène utilisés ici (c.-à-d. la catalase et la glucose-oxydase) sont nécessaires pour visualiser les protéines pendant de longues périodes de temps (de quelques minutes à quelques heures), mais sont connus pour restreindre la polymérisation des microtubules à des concentrations élevées5. En ce qui concerne ces considérations de tampon, une limitation de ce protocole est que certaines protéines régulatrices canoniques associées aux microtubules peuvent nécessiter plus ou moins de sel pour récapituler les fonctions trouvées dans les cellules ou les essais utilisant des microtubules seuls (sans actine). La modification de la nature ou de la concentration du sel pour répondre à ces préoccupations influencera probablement les taux de polymérisation des filaments d’actine et/ou les paramètres de la dynamique des microtubules. Des mesures de plusieurs paramètres descriptifs (minimal, nucléation, taux d’allongement et stabilité) (figure 3) sont nécessaires pour confirmer le succès du protocole ou pour documenter explicitement les effets de tampons ou de protéines régulatrices spécifiques. Par exemple, une trop grande polymérisation de filaments d’actine peut masquer les événements de couplage actine-microtubule en quelques secondes. Par conséquent, le réglage fin des conditions expérimentales en abaissant la concentration globale d’actine ou en incluant des protéines supplémentaires pour supprimer la nucléation de l’actine (c.-à-d. la profiline) prolongera la période globale pendant laquelle les activités coordonnées actine-microtubule peuvent être vues clairement. Les contrôles répondant à ces conditions préalables et les réplications techniques (au-delà de plusieurs champs de vision) sont essentiels pour que les utilisateurs génèrent des résultats fiables et reproductibles.

Les études cellulaires offrent une possibilité limitée d’observer les relations directes protéine-protéine ou l’action des complexes régulateurs. En revanche, certains des mécanismes glanés dans les essais in vitro ne reflètent pas toujours les comportements exacts des protéines observées dans les cellules. Ce dilemme biochimiste classique peut être abordé dans les applications futures de cette technique avec des modifications spécifiques. Par exemple, l’ajout de protéines de couplage fonctionnelles marquées par fluorescence élargit cette méthode des études à filament unique aux études à molécule unique. Les essais peuvent être modifiés pour utiliser des extraits cellulaires qui peuvent ajouter les facteurs clés inconnus « manquants » nécessaires pour récapituler les phénomènes cellulaires. Par exemple, les essais à base de TIRF utilisant des extraits de levure ou de Xenopus ont reconstitué les anneaux d’actomyosine contractile37, les fuseaux mitotiques26,38, les composants de l’assemblage d’actine ou de microtubule39,40, et même la dynamique au niveau du centrosome et des kinétochores 36,41,42,43 . De plus, de tels systèmes peuvent ouvrir la voie à des systèmes cellulaires artificiels qui ont des lipides ou des facteurs de signalisation présents 44,45,46.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Je suis reconnaissant à Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) et Brian Haarer (SUNY Upstate) pour leurs commentaires utiles sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (GM133485).

Materials

1% BSA (w/v) Fisher Scientific BP1600-100 For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80 Homemade 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO G2133-50KU Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin Cytoskeleton Inc, Denver, CO T240 Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO A-081 Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP Fisher Scientific AC226250010 Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers Leica Microsystems 11889151; 11889148
2 mg/mL catalase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO C40-100 Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer Homemade 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific, Waltham, MA 22-266882 Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) Avantor, Philadelphia, PA RLS000-01 Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener Loctite, Rocky Hill, CT 1365736 Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds Cytoskeleton Inc; Homemade T333P (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock Homemade; this protocol A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls Homemade Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) Laysan Bio Inc biotin-PEG-SIL-3400 Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin Cytoskeleton Inc; Homemade AB07 Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software www.https://imagej.net/software/fiji/downloads Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin Cytoskeleton Inc; Homemade AR05 Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin Cytoskeleton Inc TL488M, TLA590M, TL670M Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer Homemade 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer Homemade 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers IBIDI, Fitchburg, WI 80666 Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera Andor, Belfast, Northern Ireland 8114137
LASX Premium microscope software Leica Microsystems 11640611
Methylcellulose (4,000 cp) Sigma Aldrich Inc M0512
Microscope base equipped with TIRF module Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11889146
mPEG-silane (MW 2,000) Laysan Bio Inc, Arab, AL mPEG-SIL-2000 Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert OKO labs, Pozzioli, Italy 8113569 Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump Harvard Apparatus, Holliston, MA 704504 A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm Genesee Scientific, San Diego, CA 32-107
Plastic slide mailer container Fisher Scientific HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick Grace Biolabs, Bend, OR 620001 Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container Abcam, Cambridge, UK Reused from shipping
Small weigh boat Fisher Scientific 02-202-100
Spectrophotometer
Tau Cytoskeleton Inc TA01 Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective Leica Microsystems 11506319
Tubulin stock Homemade; this protocol A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark) Cytoskeleton Inc; Homemade AKL99 Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).
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Henty-Ridilla, J. L. Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e64074, doi:10.3791/64074 (2022).
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