Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).
Traditionell wurden die Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskelette als separate Einheiten untersucht, die auf bestimmte zelluläre Regionen oder Prozesse beschränkt sind und durch verschiedene Suiten von Bindungsproteinen reguliert werden, die für jedes Polymer einzigartig sind. Viele Studien zeigen nun, dass die Dynamik beider zytoskelettaler Polymere miteinander verflochten ist und dass dieses Übersprechen für die meisten zellulären Verhaltensweisen erforderlich ist. Eine Reihe von Proteinen, die an Aktin-Mikrotubuli-Interaktionen beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (z. B. Tau, MACF, GAS, Formine und mehr) und sind entweder in Bezug auf Aktin oder Mikrotubuli allein gut charakterisiert. Relativ wenige Studien zeigten jedoch Assays der Aktin-Mikrotubuli-Koordination mit dynamischen Versionen beider Polymere. Dies kann emergente Verbindungsmechanismen zwischen Aktin und Mikrotubuli ausschließen. Dabei ermöglicht eine auf der Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) basierende In-vitro-Rekonstitutionstechnik die Visualisierung sowohl der Aktin- als auch der Mikrotubuli-Dynamik aus der einen biochemischen Reaktion. Diese Technik bewahrt die Polymerisationsdynamik von Aktinfilament oder Mikrotubuli einzeln oder in Gegenwart des anderen Polymers. Das kommerziell erhältliche Tau-Protein wird verwendet, um zu demonstrieren, wie sich das Verhalten von Aktin-Mikrotubuli in Gegenwart eines klassischen zytoskelettalen Vernetzungsproteins ändert. Diese Methode kann zuverlässige funktionelle und mechanistische Einblicke liefern, wie einzelne regulatorische Proteine die Aktin-Mikrotubuli-Dynamik bei einer Auflösung einzelner Filamente oder Komplexe höherer Ordnung koordinieren.
In der Vergangenheit wurden Aktin und Mikrotubuli als getrennte Einheiten betrachtet, jede mit ihren eigenen regulatorischen Proteinen, dynamischem Verhalten und unterschiedlichen zellulären Standorten. Zahlreiche Beweise zeigen nun, dass Aktin- und Mikrotubulipolymere funktionelle Übersprechmechanismen anwenden, die für die Ausführung zahlreicher Zellprozesse unerlässlich sind, einschließlich Migration, mitotische Spindelpositionierung, intrazellulärer Transport und Zellmorphologie 1,2,3,4. Die verschiedenen koordinierten Verhaltensweisen, die diesen Beispielen zugrunde liegen, hängen von einem komplizierten Gleichgewicht von Kopplungsfaktoren, Signalen und physikalischen Eigenschaften ab. Die molekularen Details, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da sich die meisten Studien auf ein einzelnes zytoskelettales Polymer zu einem Zeitpunktkonzentrieren 1,2,5.
Aktin und Mikrotubuli interagieren nicht direkt 6,7,8. Die koordinierte Dynamik von Aktin und Mikrotubuli, die in Zellen beobachtet werden, wird durch zusätzliche Faktoren vermittelt. Viele Proteine, von denen angenommen wird, dass sie das Aktin-Mikrotubuli-Übersprechen regulieren, wurden identifiziert und ihre Aktivitäten sind in Bezug auf beide zytoskelettalen Polymere alleingut charakterisiert 1,2. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass dieser Einzelpolymeransatz die Doppelfunktionen einiger der Proteine / Komplexe verdeckt hat, die Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsereignisse ermöglichen 7,8,9,10,11,12,13. Experimente, bei denen beide Polymere vorhanden sind, sind selten und definieren oft Mechanismen mit einem einzigen dynamischen Polymer und einer statisch stabilisierten Version der anderen 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Daher werden Methoden benötigt, um die emergenten Eigenschaften von Aktin-Mikrotubuli-koordinierenden Proteinen zu untersuchen, die nur in experimentellen Systemen, die beide dynamischen Polymere verwenden, vollständig verstanden werden können.
Die Kombination von direkten Proteinmarkierungsansätzen, genetisch kodierten Affinitätsmarkierungen und TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) wurde mit großem Erfolg in biomimetischen Rekonstitutionssystemen 19,20,21,22,23 angewendet. Viele Bottom-up-Schemata enthalten nicht alle Faktoren, die Proteine in Zellen regulieren. Die “Biochemie auf einem Deckglas” -Technologie hat jedoch viele Mechanismen der Aktin- und Mikrotubulidynamik auf hohen räumlichen und zeitlichen Skalen verfeinert, einschließlich der Komponenten, die für den Polymerauf- oder –abbau und die motorische Proteinbewegung erforderlich sind 5,12,23,24,25,26,27 . Hier wird ein Minimalkomponenten-Single-Filament-Ansatz zur Untersuchung der Aktin-Mikrotubuli-Kopplung in vitro beschrieben. Dieses Protokoll kann mit kommerziell erhältlichen oder hochreinen gereinigten Proteinen, fluoreszierend markierten Proteinen, Perfusionskammern verwendet und auf kompliziertere Schemata mit Zellextrakten oder synthetischen Systemen erweitert werden. Hier wird das kommerziell erhältliche Tau-Protein verwendet, um zu demonstrieren, wie sich die Zytoskelettdynamik in Gegenwart eines Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsproteins ändert, aber durch andere mutmaßliche Aktin-Mikrotubuli-Koordinationsfaktoren ersetzt werden kann. Der Hauptvorteil dieses Systems gegenüber anderen Ansätzen ist die Möglichkeit, die Dynamik mehrerer zytoskelettaler Polymere in einer Reaktion gleichzeitig zu überwachen. Dieses Protokoll bietet Benutzern auch Beispiele und einfache Werkzeuge zur Quantifizierung von Änderungen an zytoskelettalen Polymeren. Auf diese Weise werden Protokollbenutzer zuverlässige, quantitative Einzelfilament-Auflösungsdaten erstellen, um Mechanismen zu beschreiben, die der Art und Weise zugrunde liegen, wie verschiedene regulatorische Proteine die Aktin-Mikrotubuli-Dynamik koordinieren.
Die Verwendung der Total-Interreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) zur Visualisierung gereinigter Proteine war ein fruchtbarer und überzeugender Ansatz, um einzigartige Mechanismen der Zytoskelettregulation 5,23,24,25,26,27,35 zu sezieren. Im Vergleich zu herkömmlichen biochemischen Assays erfordern TIRF-Reaktionen sehr kleine Volumina (50-100 μL), und quantitative Messungen der Zytoskelettdynamik können aus einem individuellen Assay gewonnen werden. Die meisten Studien zur Zytoskelettdynamik konzentrieren sich auf ein einzelnes Polymersystem (d. H. Aktinfilamente oder Mikrotubuli), so dass detaillierte Messungen des Übersprechens oder des emergenten Verhaltens zwischen Aktinfilamenten und Mikrotubuli, die typischerweise in Zellen beobachtet werden, im Reagenzglas schwer fassbar und schwer zu rekapitulieren sind. Um dieses Problem zu lösen, beschreibt dieses Protokoll ein Single-Filament-TIRF-Mikroskopiesystem, das die direkte Visualisierung von dynamischen Aktin- und Mikrotubulipolymeren in derselben biochemischen Reaktion ermöglicht. Somit geht diese Methode über traditionelle Assays hinaus, die das dynamische Verhalten von Aktinfilamenten oder Mikrotubuli allein rekapitulieren. Diese Technik wurde auch mit Tau als Beispiel dafür durchgeführt, wie sich mehrere dynamische Eigenschaften in Gegenwart eines Zytoskelett-Kopplungsfaktors ändern. Dieses Protokoll kann mit zusätzlichen Proteinen verwendet werden, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie die Aktin- oder Mikrotubulidynamik koordinieren, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) MACF, GAS, Formine und mehr. Schließlich können bereitgestellte Beispielanalysen als Leitfaden verwendet werden, um die mit diesem Protokoll erfassten Daten zu quantifizieren.
“Sehen heißt glauben” ist ein überzeugender Grund, mikroskopiebasierte Assays durchzuführen. Bei der Durchführung und Interpretation von TIRF-Mikroskopie-Experimenten ist jedoch Vorsicht geboten. Eine große Herausforderung bei zytoskelettalen Co-Assembly-Assays besteht darin, dass viele häufig verwendete Bildgebungsbedingungen nicht mit jedem Polymer kompatibel sind. Mikrotubuli und Aktin haben typischerweise unterschiedliche Puffer-, Temperatur-, Salz-, Nukleotid- und Konzentrationsanforderungen für die Polymerisation. Aktin, Tubulin, regulatorische Proteine von Interesse und die in diesem Protokoll verwendeten Puffer reagieren empfindlich auf Frost-Tau-Zyklen. Daher ist ein sorgfältiger Umgang mit Proteinen und Puffern notwendig, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Um viele dieser Bedenken zu zerstreuen, wird dringend empfohlen, frisch recyceltes Tubulin (<6 Wochen gefroren) zu verwenden und gefrorene / suspendierte Aktine über Ultrazentrifugation vorzuklären. Diese Überlegungen gelten auch für die unzähligen regulatorischen Proteine, die mit diesem Verfahren bewertet werden sollen, die empfindlich auf Gefrier-Tau-Zyklen oder die Konzentration von Puffersalzen 5,11,36 reagieren können.
Leider gibt es keinen einheitlichen Puffer ohne experimentelle Kompromisse. Um mehr Volumen für Proteine niedrigerer Konzentration zu erhalten, können ATP und GTP in die 2x-TIRF-Pufferlösung eingeschlossen werden (Abbildung 1C). Da diese Nukleotide jedoch extrem empfindlich auf Frost-Tau-Zyklen reagieren, wird dies nicht empfohlen. Die hier verwendeten Sauerstofffängerverbindungen (d. H. Katalase und Glucoseoxidase) sind notwendig, um Proteine über lange Zeiträume (Minuten bis Stunden) sichtbar zu machen, aber es ist bekannt, dass sie die Mikrotubulipolymerisation bei hohen Konzentrationen einschränken5. Im Zusammenhang mit diesen Pufferüberlegungen besteht eine Einschränkung dieses Protokolls darin, dass einige kanonische Mikrotubuli-assoziierte regulatorische Proteine mehr oder weniger Salz benötigen, um Funktionen in Zellen oder Assays mit Mikrotubuli allein (ohne Aktin) zu rekapitulieren. Eine Änderung der Art oder Konzentration von Salz, um diese Bedenken auszuräumen, wird wahrscheinlich die Raten der Aktinfilamentpolymerisation und / oder die Parameter der Mikrotubulidynamik beeinflussen. Messungen mehrerer deskriptiver Parameter (minimal, Keimbildung, Dehnungsraten und Stabilität) (Abbildung 3) sind erforderlich, um den Protokollerfolg zu bestätigen oder die Auswirkungen spezifischer Puffer oder regulatorischer Proteine explizit zu dokumentieren. Zum Beispiel kann eine zu starke Polymerisation von Aktinfilamenten Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsereignisse innerhalb von Sekunden verschleiern. Folglich wird die Feinabstimmung der experimentellen Bedingungen durch Senkung der Gesamtkonzentration von Aktin oder Einbeziehung zusätzlicher Proteine zur Unterdrückung der Aktinkeimbildung (d. H. Profilin) den Gesamtzeitraum verlängern, in dem koordinierte Aktin-Mikrotubuli-Aktivitäten deutlich sichtbar gemacht werden können. Kontrollen, die diese Voraussetzungen erfüllen, und technische Replikate (über mehrere Sichtfelder hinaus) sind für Benutzer von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Zellbasierte Studien bieten nur begrenzte Möglichkeiten, direkte Protein-Protein-Beziehungen oder die Wirkung von regulatorischen Komplexen zu beobachten. Im Gegensatz dazu spiegeln einige der aus In-vitro-Assays gewonnenen Mechanismen nicht immer das genaue Verhalten von Proteinen wider, die in Zellen beobachtet werden. Dieses klassische biochemistische Dilemma kann in zukünftigen Anwendungen dieser Technik mit spezifischen Modifikationen angegangen werden. Zum Beispiel erweitert die Zugabe von funktionellen fluoreszenzmarkierten Kopplungsproteinen diese Methode von Einzelfilamentstudien zu Einzelmolekülstudien. Assays können weiter modifiziert werden, um Zellextrakte zu verwenden, die die “fehlenden” unbekannten Schlüsselfaktoren hinzufügen können, die erforderlich sind, um zellähnliche Phänomene zu rekapitulieren. Zum Beispiel haben TIRF-basierte Assays, die Hefe- oder Xenopus-Extrakte verwenden, kontraktile Actomyosin-Ringe37, mitotische Spindeln 26,38, Komponenten der Aktin- oder Mikrotubuli-Assemblierung 39,40 und sogar Dynamik am Zentrosom und Kinetochore 36,41,42,43 rekonstituiert. . Darüber hinaus können solche Systeme den Weg zu künstlichen Zellsystemen ebnen, deren Lipide oder Signalfaktoren 44,45,46 vorhanden sind.
The authors have nothing to disclose.
Ich danke Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) und Brian Haarer (SUNY Upstate) für hilfreiche Kommentare zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM133485) unterstützt.
1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
37 oC heatblock | |||
37 oC water bath | |||
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
70 oC incubator | |||
Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
Dry ice | |||
FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
Ice | |||
Ice bucket | |||
Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
Spectrophotometer | |||
Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |