Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée
Summary
La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.
Abstract
Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour visualiser des cellules individuelles dans tout le corps de poissons-zèbres embryonnaires, larvaires ou juvéniles vivants. Nous montrons que les poissons vivants avec des membranes plasmiques marquées par fluorescence peuvent être scannés dans un microscope confocal à balayage laser afin de déterminer le volume de tissu musculaire et le nombre de fibres musculaires présentes. Des approches efficaces pour la mesure du nombre et de la taille des cellules chez les animaux vivants au fil du temps sont décrites et validées par rapport à des méthodes de segmentation plus ardues. Des méthodes sont décrites qui permettent le contrôle de l’activité électrique musculaire, et donc contractile. La perte de contractile des muscles squelettiques a considérablement réduit la croissance musculaire. Chez les larves, un protocole est décrit qui permet la réintroduction d’une activité contractile évoquée électriquement. Les méthodes décrites minimisent l’effet de la variabilité interindividuelle et permettront d’analyser l’effet des stimuli électriques, génétiques, médicamenteux ou environnementaux sur une variété de paramètres de croissance cellulaire et physiologique dans le contexte de l’organisme vivant. Un suivi à long terme des effets mesurés d’une intervention définie en début de vie sur les individus peut ensuite être effectué.
Introduction
La croissance tissulaire régulée, comprenant l’augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et / ou de la taille des cellules (hypertrophie), est un facteur crucial dans le développement, la régénération et l’adaptation écologique et évolutive. Malgré d’énormes progrès dans la compréhension génétique moléculaire de la biologie cellulaire et du développement au cours des dernières décennies, la compréhension mécaniste de la régulation de la taille des tissus et des organes en est encore à ses balbutiements. L’une des raisons de cette lacune dans les connaissances est la difficulté de quantifier la croissance tissulaire dans les organismes vivants avec la précision spatiale et temporelle nécessaire.
Divers aspects de la croissance d’organismes entiers peuvent être mesurés à plusieurs reprises au fil du temps, révélant des courbes de croissance pour chaque individu 1,2,3,4,5. Des méthodes de balayage de plus en plus sophistiquées, telles que l’absorptiométrie à rayons X (DXA), la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), permettent de suivre la croissance d’organes entiers et d’autres régions du corps (par exemple, les muscles squelettiques identifiés individuellement) chez des individus isolés, humains et modèles 6,7,8,9,10 . Cependant, ces méthodes n’ont pas encore la résolution de révéler des cellules individuelles et donc les liens entre les comportements cellulaires et la croissance au niveau des tissus ont été difficiles à discerner. Pour établir de tels liens, les études traditionnelles se sont souvent appuyées sur des cohortes d’animaux individuels similaires, dont quelques-uns sont sacrifiés à des moments successifs, puis analysés en détail cytologique. De telles approches nécessitent de faire la moyenne des changements observés entre des groupes d’individus (de préférence similaires, mais néanmoins variables) et souffrent donc d’un manque de résolution temporelle et spatiale, ce qui rend difficile la recherche d’événements corrélés au niveau cellulaire suggérant une cause et un effet.
Des études sur des organismes modèles d’invertébrés, initialement chez C. elegans et D. melanogaster, ont contourné ces problèmes en développant la microscopie optique pour atteindre une résolution cellulaire et mesurer avec précision la croissance au fil du temps chez des individus individuels. De telles études ont révélé des comportements de lignée cellulaire étonnamment invariants dans la croissance de ces petits organismes modèles 11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux animaux, y compris tous les vertébrés, ont des lignées cellulaires indéterminées et contrôlent la croissance des tissus par de mystérieux processus de rétroaction qui servent à transformer le programme de croissance codé génétiquement en un organisme fonctionnel tridimensionnel avec tous ses tissus constitutifs et organes de taille appropriée. Pour comprendre ces processus de croissance complexes, il est souhaitable d’imager des tissus ou des organes entiers au fil du temps chez des individus uniques qui peuvent être manipulés expérimentalement par des interventions génétiques, pharmacologiques ou autres au moment de leur choix et dont l’effet est analysé par la suite.
Chaque muscle squelettique des vertébrés a une taille, une forme et une fonction définies, et des interactions bien caractérisées avec les tissus adjacents, tels que les os, les tendons et les nerfs. Certains muscles sont petits, se trouvent juste sous la peau et sont donc de bons candidats pour les études d’imagerie à haute résolution. Comme la plupart des organes, chaque muscle se développe tout au long de la vie embryonnaire, postnatale et juvénile, avant d’atteindre une taille adulte stable. Le muscle, cependant, a également une capacité unique à changer de taille au cours de la vie adulte, en fonction de l’utilisation et de la nutrition18, et cette propriété a un impact majeur sur la forme physique de l’organisme, la performance sportive et la vie autonome. La perte de masse musculaire et de fonction chez les personnes âgées, la sarcopénie, est un problème de plus en plus préoccupant pour les sociétés confrontées à une population vieillissante 19,20,21.
Nous et d’autres nous sommes concentrés sur la croissance de blocs définis de tissu musculaire squelettique dans le corps segmenté des larves de poisson zèbre, en tant que système apparemment fermé contenant plusieurs centaines de cellules dans lequel la croissance, l’entretien et la réparation des tissus peuvent être observés et manipulés 22,23,24,25,26. Bien que certains travaux quantitatifs aient déjà été rapportés 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, aucune méthode détaillée et validée de mesure de la croissance musculaire dans les détails cellulaires chez les organismes vertébrés individuels au fil du temps n’est disponible. Ici, un protocole efficace sur la façon d’effectuer de telles mesures répétées est décrit, ainsi que la validation, et un exemple de son utilisation pour analyser les changements dans la croissance hypertrophique et hyperplasique en réponse à une activité électrique altérée est fourni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons ici une méthode pour une estimation précise et efficace du volume musculaire des larves de poisson-zèbre vivants à des stades ou dans des variantes génétiques dans lesquels la pigmentation n’est pas un obstacle majeur à l’imagerie et lorsque l’anesthésie transitoire et / ou l’immobilisation est bien tolérée. Alors que nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser, les approches décrites sont applicables à la microscopie confocale à disque rotatif ou à feuille de lumi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont profondément redevables aux efforts des membres du laboratoire Hughes, les Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin et Vladimir Snetkov pour le développement des protocoles décrits, et à Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau et Peter Currie pour le partage de plasmides ou de lignées de poissons-zèbres. SMH est un scientifique du Conseil de recherches médicales (CRM) avec la subvention de programme G1001029, MR/N021231/1 et MR/W001381/1. MA a été titulaire d’une bourse de doctorat du programme de formation doctorale MRC du King’s College de Londres. Ce travail a bénéficié de l’apport trigonométrique de David M. Robinson, érudit, mentor et ami.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
