Summary

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Abstract

Eine Reihe von Methoden kann verwendet werden, um einzelne Zellen im ganzen Körper von lebenden embryonalen, larven oder juvenilen Zebrafischen sichtbar zu machen. Wir zeigen, dass lebende Fische mit fluoreszenzmarkierten Plasmamembranen in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop gescannt werden können, um das Volumen des Muskelgewebes und die Anzahl der vorhandenen Muskelfasern zu bestimmen. Effiziente Ansätze zur Messung der Zellanzahl und -größe in lebenden Tieren im Zeitverlauf werden beschrieben und anhand aufwändigerer Segmentierungsmethoden validiert. Es werden Methoden beschrieben, die die Steuerung der elektrischen und damit kontraktilen Muskelaktivität erlauben. Der Verlust der kontraktilen Aktivität der Skelettmuskulatur reduzierte das Muskelwachstum stark. Bei Larven wird ein Protokoll beschrieben, das die Wiedereinführung einer strukturierten, elektrisch evozierten kontraktilen Aktivität ermöglicht. Die beschriebenen Methoden minimieren den Effekt interindividueller Variabilität und erlauben es, die Wirkung von elektrischen, genetischen, medikamentösen oder Umweltreizen auf eine Vielzahl von zellulären und physiologischen Wachstumsparametern im Kontext des lebenden Organismus zu analysieren. Anschließend kann eine Langzeitnachbeobachtung der gemessenen Effekte einer definierten Frühlebensintervention auf Individuen durchgeführt werden.

Introduction

Das regulierte Gewebewachstum, bestehend aus einer Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie) und/oder Zellgröße (Hypertrophie), ist ein entscheidender Faktor für Entwicklung, Regeneration sowie ökologische und evolutionäre Anpassung. Trotz enormer Fortschritte im molekulargenetischen Verständnis sowohl der Zell- als auch der Entwicklungsbiologie in den letzten Jahrzehnten steckt das mechanistische Verständnis der Regulation von Gewebe und Organgröße noch in den Kinderschuhen. Ein Grund für diese Wissenslücke ist die Schwierigkeit, das Gewebewachstum in lebenden Organismen mit der notwendigen räumlichen und zeitlichen Genauigkeit zu quantifizieren.

Verschiedene Aspekte des Wachstums ganzer Organismen können im Laufe der Zeit wiederholt gemessen werden, wobei Wachstumskurven für jedes Individuum 1,2,3,4,5 sichtbar werden. Immer ausgefeiltere Scanmethoden wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA), die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglichen die Verfolgung des Wachstums ganzer Organe und anderer Körperregionen (z. B. einzelne identifizierte Skelettmuskeln) bei einzelnen Individuen, sowohl beim Menschen als auch in Modellorganismen 6,7,8,9,10 . Diese Methoden haben jedoch noch nicht die Auflösung, einzelne Zellen aufzudecken, und daher waren die Zusammenhänge zwischen zellulärem Verhalten und Wachstum auf Gewebeebene schwer zu erkennen. Um solche Verbindungen herzustellen, haben sich traditionelle Studien oft auf Kohorten ähnlicher Einzeltiere gestützt, von denen einige zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten geopfert und dann zytologisch detailliert analysiert werden. Solche Ansätze erfordern die Mittelung der beobachteten Veränderungen über Gruppen von (vorzugsweise ähnlichen, aber dennoch variablen) Individuen hinweg und leiden daher unter einem Mangel an zeitlicher und räumlicher Auflösung, was es schwierig macht, korrelierte Ereignisse auf zellulärer Ebene zu finden, die auf Ursache und Wirkung hindeuten.

Studien an wirbellosen Modellorganismen, zunächst in C. elegans und D. melanogaster, haben diese Probleme umgangen, indem sie optische Mikroskopie entwickelt haben, um eine zelluläre Auflösung zu erreichen und das Wachstum im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen genau zu messen. Solche Studien haben auffallend invariantes Zelllinienverhalten im Wachstum dieser kleinen Modellorganismen 11,12,13,14,15,16,17 gezeigt. Viele Tiere, einschließlich aller Wirbeltiere, haben jedoch unbestimmte Zelllinien und kontrollieren das Gewebewachstum durch mysteriöse Rückkopplungsprozesse, die dazu dienen, das genetisch kodierte Wachstumsprogramm in einen funktionsfähigen dreidimensionalen Organismus mit all seinen Geweben und Organen zu verwandeln, die in der Größe entsprechend aufeinander abgestimmt sind. Um diese komplexen Wachstumsprozesse zu verstehen, ist es wünschenswert, ganze Gewebe oder Organe im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen abzubilden, die durch genetische, pharmakologische oder andere Interventionen zu einem Zeitpunkt der Wahl experimentell manipuliert und die Wirkung anschließend analysiert werden können.

Jeder Skelettmuskel von Wirbeltieren hat eine definierte Größe, Form und Funktion und gut charakterisierte Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben wie Knochen, Sehnen und Nerven. Einige Muskeln sind klein, liegen knapp unter der Haut und sind daher gute Kandidaten für hochauflösende bildgebende Studien. Ähnlich wie bei den meisten Organen wächst jeder Muskel während des embryonalen, postnatalen und jugendlichen Lebens, bevor er eine stabile Erwachsenengröße erreicht. Muskeln haben jedoch auch eine einzigartige Fähigkeit, die Größe während des Erwachsenenlebens zu ändern, abhängig von Gebrauch und Ernährung18, und diese Eigenschaft hat einen großen Einfluss auf die Fitness des Organismus, die sportliche Leistung und das unabhängige Leben. Der Verlust von Muskelmasse und -funktion im Alter, Sarkopenie, ist ein Thema, das für Gesellschaften mit einer alternden Bevölkerung zunehmend Anlass zur Sorge gibt 19,20,21.

Wir und andere haben uns auf das Wachstum definierter Blöcke von Skelettmuskelgewebe im sich segmental wiederholenden Körper von Zebrafischlarven konzentriert, als ein scheinbar geschlossenes System mit mehreren hundert Zellen, in dem Gewebewachstum, -erhaltung und -reparatur beobachtet und manipuliert werden können 22,23,24,25,26. Während einige quantitative Arbeiten zuvor berichtet wurden 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, ist keine detaillierte und validierte Methode zur Messung des Muskelwachstums in zellulären Details in einzelnen Wirbeltierorganismen im Laufe der Zeit verfügbar. Hier wird ein effizientes Protokoll für die Durchführung solcher wiederholten Messungen beschrieben, zusammen mit der Validierung, und ein Beispiel für seine Verwendung zur Analyse von Veränderungen sowohl des hypertrophen als auch des hyperplastischen Wachstums als Reaktion auf veränderte elektrische Aktivität wird bereitgestellt.

Protocol

Alle beschriebenen Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und unter geeigneten Lizenzen des britischen Innenministeriums in Übereinstimmung mit dem Animal (Scientific Procedures) Act 1986 und nachfolgenden Änderungen durchgeführt. Embryonen/Larven sollten bis zum Abschluss der Gastrulation bei 28,5 °C aufgezogen werden, können dann aber bei 22-31 °C gehalten werden, um die Entwicklungsgeschwindigkeit zu kontrollieren. Fische können bei Raumtemperatur gescannt oder stimuliert…

Representative Results

Eine schnelle und präzise Messung des Somit-VolumensEs wird eine Methode der Probenvorbereitung, Datenerfassung und volumetrischen Analyse beschrieben, die die schnelle Messung des Muskelwachstums in Zebrafischlarven ermöglicht. Die Muskelgröße kann bei lebenden Tieren gemessen werden, indem Fische verwendet werden, die auf ihren Plasmamembranen mit einem membrangezielten GFP (β-Aktin:HRAS-EGFP ) oder mCherry (α-Aktin:mCherry-CAAX ) markiert sind. Die Larven wurden vorübergeh…

Discussion

Hier berichten wir über eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung des Muskelvolumens lebender Zebrafischlarven in Stadien oder in genetischen Varianten, bei denen die Pigmentierung kein großes Hindernis für die Bildgebung darstellt und wenn eine vorübergehende Anästhesie und/oder Immobilisierung gut toleriert wird. Während wir die konfokale Laserscanning-Mikroskopie verwendet haben, sind die beschriebenen Ansätze auf die konfokale Spinnscheiben- oder Lichtblattmikroskopie und auf jede andere Methode anwe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren sind den Bemühungen der Hughes-Labormitglieder Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin und Vladimir Snetkov für die Entwicklung der beschriebenen Protokolle sowie Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau und Peter Currie für die gemeinsame Nutzung von Plasmiden oder Zebrafischlinien zu großem Dank verpflichtet. SMH ist Wissenschaftler des Medical Research Council (MRC) mit Programmzuschuss G1001029, MR/N021231/1 und MR/W001381/1. MA hatte ein MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship vom King’s College London. Diese Arbeit profitierte vom trigonometrischen Input von David M. Robinson, Gelehrter, Mentor und Freund.

Materials

Adhesive, Blu Tack Bostik
Aerosol vacuum 
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414 Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater Cole-Parmer SBH130
BODIPY FL C5-ceramide Thermo Scientific D3521 To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires
Fiji/imageJ National Institutes of Health, NIH
Fish medium, Fish water Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope Leica Leica MZ16F Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle World Precision Instruments, Inc. 1B100-6 To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator Grass Instruments S88 Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 13258179
Laser scanning microscope (LSM)  Zeiss Zeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880
LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate Thermo Scientific 140675
Objective, 20×/1.0W water immersion Zeiss
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL Starlab Group E1414-0100
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL Starlab Group E1414-1100
Petri dish, 60 mm Sigma-Aldrich P5481
Plasmid, CMV-Cerulean Christina L. Hammond (University of Bristol) pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX Henry Roehl (University of Sheffield) For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller  Hoefer Scientific Instruments PC750
Soldering iron
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc
Watchmaker forceps, No. 5
Wire, Platinum Goodfellow PT005142/12 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver Acros Organics 317730010 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software Zeiss

References

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Play Video

Cite This Article
Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity. J. Vis. Exp. (184), e64063, doi:10.3791/64063 (2022).

View Video