Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind
Summary
Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.
Abstract
Eine Reihe von Methoden kann verwendet werden, um einzelne Zellen im ganzen Körper von lebenden embryonalen, larven oder juvenilen Zebrafischen sichtbar zu machen. Wir zeigen, dass lebende Fische mit fluoreszenzmarkierten Plasmamembranen in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop gescannt werden können, um das Volumen des Muskelgewebes und die Anzahl der vorhandenen Muskelfasern zu bestimmen. Effiziente Ansätze zur Messung der Zellanzahl und -größe in lebenden Tieren im Zeitverlauf werden beschrieben und anhand aufwändigerer Segmentierungsmethoden validiert. Es werden Methoden beschrieben, die die Steuerung der elektrischen und damit kontraktilen Muskelaktivität erlauben. Der Verlust der kontraktilen Aktivität der Skelettmuskulatur reduzierte das Muskelwachstum stark. Bei Larven wird ein Protokoll beschrieben, das die Wiedereinführung einer strukturierten, elektrisch evozierten kontraktilen Aktivität ermöglicht. Die beschriebenen Methoden minimieren den Effekt interindividueller Variabilität und erlauben es, die Wirkung von elektrischen, genetischen, medikamentösen oder Umweltreizen auf eine Vielzahl von zellulären und physiologischen Wachstumsparametern im Kontext des lebenden Organismus zu analysieren. Anschließend kann eine Langzeitnachbeobachtung der gemessenen Effekte einer definierten Frühlebensintervention auf Individuen durchgeführt werden.
Introduction
Das regulierte Gewebewachstum, bestehend aus einer Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie) und/oder Zellgröße (Hypertrophie), ist ein entscheidender Faktor für Entwicklung, Regeneration sowie ökologische und evolutionäre Anpassung. Trotz enormer Fortschritte im molekulargenetischen Verständnis sowohl der Zell- als auch der Entwicklungsbiologie in den letzten Jahrzehnten steckt das mechanistische Verständnis der Regulation von Gewebe und Organgröße noch in den Kinderschuhen. Ein Grund für diese Wissenslücke ist die Schwierigkeit, das Gewebewachstum in lebenden Organismen mit der notwendigen räumlichen und zeitlichen Genauigkeit zu quantifizieren.
Verschiedene Aspekte des Wachstums ganzer Organismen können im Laufe der Zeit wiederholt gemessen werden, wobei Wachstumskurven für jedes Individuum 1,2,3,4,5 sichtbar werden. Immer ausgefeiltere Scanmethoden wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA), die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglichen die Verfolgung des Wachstums ganzer Organe und anderer Körperregionen (z. B. einzelne identifizierte Skelettmuskeln) bei einzelnen Individuen, sowohl beim Menschen als auch in Modellorganismen 6,7,8,9,10 . Diese Methoden haben jedoch noch nicht die Auflösung, einzelne Zellen aufzudecken, und daher waren die Zusammenhänge zwischen zellulärem Verhalten und Wachstum auf Gewebeebene schwer zu erkennen. Um solche Verbindungen herzustellen, haben sich traditionelle Studien oft auf Kohorten ähnlicher Einzeltiere gestützt, von denen einige zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten geopfert und dann zytologisch detailliert analysiert werden. Solche Ansätze erfordern die Mittelung der beobachteten Veränderungen über Gruppen von (vorzugsweise ähnlichen, aber dennoch variablen) Individuen hinweg und leiden daher unter einem Mangel an zeitlicher und räumlicher Auflösung, was es schwierig macht, korrelierte Ereignisse auf zellulärer Ebene zu finden, die auf Ursache und Wirkung hindeuten.
Studien an wirbellosen Modellorganismen, zunächst in C. elegans und D. melanogaster, haben diese Probleme umgangen, indem sie optische Mikroskopie entwickelt haben, um eine zelluläre Auflösung zu erreichen und das Wachstum im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen genau zu messen. Solche Studien haben auffallend invariantes Zelllinienverhalten im Wachstum dieser kleinen Modellorganismen 11,12,13,14,15,16,17 gezeigt. Viele Tiere, einschließlich aller Wirbeltiere, haben jedoch unbestimmte Zelllinien und kontrollieren das Gewebewachstum durch mysteriöse Rückkopplungsprozesse, die dazu dienen, das genetisch kodierte Wachstumsprogramm in einen funktionsfähigen dreidimensionalen Organismus mit all seinen Geweben und Organen zu verwandeln, die in der Größe entsprechend aufeinander abgestimmt sind. Um diese komplexen Wachstumsprozesse zu verstehen, ist es wünschenswert, ganze Gewebe oder Organe im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen abzubilden, die durch genetische, pharmakologische oder andere Interventionen zu einem Zeitpunkt der Wahl experimentell manipuliert und die Wirkung anschließend analysiert werden können.
Jeder Skelettmuskel von Wirbeltieren hat eine definierte Größe, Form und Funktion und gut charakterisierte Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben wie Knochen, Sehnen und Nerven. Einige Muskeln sind klein, liegen knapp unter der Haut und sind daher gute Kandidaten für hochauflösende bildgebende Studien. Ähnlich wie bei den meisten Organen wächst jeder Muskel während des embryonalen, postnatalen und jugendlichen Lebens, bevor er eine stabile Erwachsenengröße erreicht. Muskeln haben jedoch auch eine einzigartige Fähigkeit, die Größe während des Erwachsenenlebens zu ändern, abhängig von Gebrauch und Ernährung18, und diese Eigenschaft hat einen großen Einfluss auf die Fitness des Organismus, die sportliche Leistung und das unabhängige Leben. Der Verlust von Muskelmasse und -funktion im Alter, Sarkopenie, ist ein Thema, das für Gesellschaften mit einer alternden Bevölkerung zunehmend Anlass zur Sorge gibt 19,20,21.
Wir und andere haben uns auf das Wachstum definierter Blöcke von Skelettmuskelgewebe im sich segmental wiederholenden Körper von Zebrafischlarven konzentriert, als ein scheinbar geschlossenes System mit mehreren hundert Zellen, in dem Gewebewachstum, -erhaltung und -reparatur beobachtet und manipuliert werden können 22,23,24,25,26. Während einige quantitative Arbeiten zuvor berichtet wurden 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, ist keine detaillierte und validierte Methode zur Messung des Muskelwachstums in zellulären Details in einzelnen Wirbeltierorganismen im Laufe der Zeit verfügbar. Hier wird ein effizientes Protokoll für die Durchführung solcher wiederholten Messungen beschrieben, zusammen mit der Validierung, und ein Beispiel für seine Verwendung zur Analyse von Veränderungen sowohl des hypertrophen als auch des hyperplastischen Wachstums als Reaktion auf veränderte elektrische Aktivität wird bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir über eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung des Muskelvolumens lebender Zebrafischlarven in Stadien oder in genetischen Varianten, bei denen die Pigmentierung kein großes Hindernis für die Bildgebung darstellt und wenn eine vorübergehende Anästhesie und/oder Immobilisierung gut toleriert wird. Während wir die konfokale Laserscanning-Mikroskopie verwendet haben, sind die beschriebenen Ansätze auf die konfokale Spinnscheiben- oder Lichtblattmikroskopie und auf jede andere Methode anwe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind den Bemühungen der Hughes-Labormitglieder Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin und Vladimir Snetkov für die Entwicklung der beschriebenen Protokolle sowie Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau und Peter Currie für die gemeinsame Nutzung von Plasmiden oder Zebrafischlinien zu großem Dank verpflichtet. SMH ist Wissenschaftler des Medical Research Council (MRC) mit Programmzuschuss G1001029, MR/N021231/1 und MR/W001381/1. MA hatte ein MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship vom King’s College London. Diese Arbeit profitierte vom trigonometrischen Input von David M. Robinson, Gelehrter, Mentor und Freund.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
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