في الوقت الحقيقي والقياس المتكرر لنمو العضلات الهيكلية في أسماك الزرد الحية الفردية المعرضة لنشاط كهربائي متغير
Summary
الوضوح البصري هو ميزة رئيسية للعمل البيولوجي والفسيولوجي للخلية في أسماك الزرد. يتم وصف طرق قوية لقياس نمو الخلايا في الحيوانات الفردية التي تسمح برؤى جديدة حول كيفية دمج نمو العضلات الهيكلية والأنسجة المجاورة مع نمو الجسم كله.
Abstract
يمكن استخدام عدد من الطرق لتصور الخلايا الفردية في جميع أنحاء الجسم من أسماك الزرد الجنينية أو اليرقية أو الأحداث الحية. لقد أظهرنا أنه يمكن مسح الأسماك الحية ذات الأغشية البلازمية ذات العلامات الفلورية في مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري من أجل تحديد حجم الأنسجة العضلية وعدد الألياف العضلية الموجودة. يتم وصف النهج الفعالة لقياس عدد الخلايا وحجمها في الحيوانات الحية بمرور الوقت والتحقق من صحتها مقابل طرق تجزئة أكثر صعوبة. يتم وصف الطرق التي تسمح بالتحكم في النشاط الكهربائي للعضلات ، وبالتالي الانقباض. فقدان نشاط انقباض العضلات الهيكلية قلل بشكل كبير من نمو العضلات. في اليرقات ، يتم وصف بروتوكول يسمح بإعادة إدخال نشاط الانقباض النمطي المستحضر كهربائيا. تقلل الطرق الموصوفة من تأثير التباين بين الأفراد وستسمح بتحليل تأثير المحفزات الكهربائية أو الوراثية أو الدوائية أو البيئية على مجموعة متنوعة من معلمات النمو الخلوي والفسيولوجي في سياق الكائن الحي. يمكن إجراء متابعة طويلة الأجل للآثار المقاسة لتدخل محدد في وقت مبكر من الحياة على الأفراد في وقت لاحق.
Introduction
نمو الأنسجة المنظمة ، بما في ذلك الزيادة في عدد الخلايا (فرط التنسج) و / أو حجم الخلية (التضخم) ، هو عامل حاسم في التنمية والتجديد والتكيف البيئي والتطوري. على الرغم من التقدم الهائل في الفهم الجيني الجزيئي لكل من البيولوجيا الخلوية والتنموية على مدى العقود الأخيرة ، إلا أن الفهم الميكانيكي لتنظيم الأنسجة وحجم الأعضاء لا يزال في مهده. أحد أسباب هذه الثغرة في المعرفة هو صعوبة قياس نمو الأنسجة في الكائنات الحية بدقة مكانية وزمنية ضرورية.
يمكن قياس الجوانب المختلفة لنمو الكائنات الحية بأكملها بشكل متكرر بمرور الوقت ، مما يكشف عن منحنيات النمو لكل فرد1،2،3،4،5. تسمح طرق المسح الضوئي المتطورة بشكل متزايد ، مثل قياس امتصاص الأشعة السينية المزدوجة (DXA) ، والتصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، بتتبع نمو أعضاء كاملة ومناطق الجسم الأخرى (على سبيل المثال ، عضلات الهيكل العظمي الفردية المحددة) في الأفراد الفرديين ، سواء في البشر أو في الكائنات الحية النموذجية6،7،8،9،10 . ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليس لديها بعد القرار للكشف عن الخلايا الفردية ، وبالتالي كان من الصعب تمييز الروابط بين السلوكيات الخلوية ونمو مستوى الأنسجة. ولإقامة مثل هذه الروابط، غالبا ما اعتمدت الدراسات التقليدية على مجموعات من الحيوانات الفردية المماثلة، والتي يتم التضحية بعدد قليل منها في نقاط زمنية متتالية ثم تحليلها بالتفصيل الخلوي. وتتطلب هذه النهج متوسط التغيرات المرصودة عبر مجموعات من الأفراد (يفضل أن يكونوا متشابهين، ولكن مع ذلك متغيرين)، وبالتالي يعانون من نقص في الدقة الزمنية والمكانية، مما يجعل من الصعب العثور على أحداث مترابطة على المستوى الخلوي توحي بالسبب والنتيجة.
وقد تحايلت الدراسات التي أجريت على الكائنات الحية النموذجية لللافقاريات، في البداية في C. elegans و D. melanogaster، على هذه المشاكل من خلال تطوير الفحص المجهري البصري لتحقيق الدقة الخلوية وقياس النمو بدقة بمرور الوقت لدى الأفراد الفرديين. وقد كشفت مثل هذه الدراسات عن سلوكيات سلالة الخلايا الثابتة بشكل لافت للنظر في نمو هذه الكائنات الحية النموذجية الصغيرة11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن العديد من الحيوانات ، بما في ذلك جميع الفقاريات ، لديها سلالات خلايا غير محددة ، وتتحكم في نمو الأنسجة من خلال عمليات التغذية المرتدة الغامضة التي تعمل على تحويل برنامج النمو المشفر وراثيا إلى كائن حي ثلاثي الأبعاد وظيفي مع جميع أنسجته وأعضائه المكونة لها متطابقة بشكل مناسب في الحجم. لفهم عمليات النمو المعقدة هذه ، من المستحسن تصوير أنسجة أو أعضاء كاملة بمرور الوقت في أفراد فرديين يمكن التلاعب بهم تجريبيا عن طريق التدخلات الوراثية أو الدوائية أو غيرها في وقت الاختيار وتحليل التأثير لاحقا.
كل عضلة هيكلية فقارية لها حجم وشكل ووظيفة محددة ، وتفاعلات مميزة بشكل جيد مع الأنسجة المجاورة ، مثل العظام والأوتار والأعصاب. بعض العضلات صغيرة ، وتقع تحت الجلد مباشرة ، وبالتالي فهي مرشحة جيدة لدراسات التصوير عالية الدقة. على غرار معظم الأعضاء ، تنمو كل عضلة طوال الحياة الجنينية وما بعد الولادة والأحداث ، قبل الوصول إلى حجم بالغ مستقر. ومع ذلك ، تتمتع العضلات أيضا بقدرة فريدة على تغيير الحجم خلال حياة البالغين ، اعتمادا على الاستخدام والتغذية18 ، وهذه الخاصية لها تأثير كبير على اللياقة البدنية للكائنات الحية ، والأداء الرياضي ، والعيش المستقل. فقدان كتلة العضلات ووظيفتها في سن الشيخوخة ، ساركوبينيا ، هو قضية تثير قلقا متزايدا للمجتمعات التي تواجه شيخوخة السكان19،20،21.
لقد ركزنا نحن وآخرون على نمو كتل محددة من الأنسجة العضلية الهيكلية في الجسم المتكرر جزئيا ليرقات الزرد ، كنظام مغلق على ما يبدو يحتوي على عدة مئات من الخلايا حيث يمكن ملاحظة نمو الأنسجة وصيانتها وإصلاحها والتلاعب بها22،23،24،25،26. في حين تم الإبلاغ سابقا عن بعض الأعمال الكمية 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ، لا تتوفر طريقة مفصلة ومعتمدة لقياس نمو العضلات بالتفاصيل الخلوية في الكائنات الفقارية الفردية بمرور الوقت. هنا يتم وصف بروتوكول فعال لكيفية إجراء مثل هذه القياسات المتكررة ، إلى جانب التحقق من الصحة ، ويتم توفير مثال على استخدامه لتحليل التغيرات في كل من النمو الضخامي والمفرط استجابة للنشاط الكهربائي المتغير.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نبلغ عن طريقة للتقدير الدقيق والفعال لحجم العضلات من يرقات الزرد الحية في مراحل أو في المتغيرات الجينية التي لا يكون فيها التصبغ عائقا كبيرا أمام التصوير وعندما يكون التخدير العابر و / أو التجميد جيد التحمل. في حين أننا استخدمنا المجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر ، فإن الأساليب الموصو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون مدينون بشدة لجهود أعضاء مختبر هيوز الدكتور سيتارامايا أتيلي وجانا كوث وفرناندا باجانكا وفيكتوريا سي ويليامز ويانيف هينيتس وجورجيا بيرجامين وفلاديمير سنيتكوف لتطوير البروتوكولات الموصوفة ، وإلى هنري روهل وكريستينا هاموند وديفيد لانجيناو وبيتر كوري لمشاركة البلازميدات أو خطوط الزرد. SMH هو عالم في مجلس البحوث الطبية (MRC) مع منحة البرنامج G1001029 و MR / N021231 / 1 و MR / W001381 / 1support. عقد MA برنامج تدريب الدكتوراه MRC دكتوراه من كلية كينغز كوليدج لندن. استفاد هذا العمل من المدخلات المثلثية لديفيد م. روبنسون ، الباحث والمرشد والصديق.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
