Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit
Summary
Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.
Abstract
Een aantal methoden kan worden gebruikt om individuele cellen in het hele lichaam van levende embryonale, larvale of juveniele zebravissen te visualiseren. We laten zien dat levende vissen met fluorescerend gemarkeerde plasmamembranen kunnen worden gescand in een confocale laserscanmicroscoop om het volume spierweefsel en het aantal aanwezige spiervezels te bepalen. Efficiënte benaderingen voor het meten van het aantal en de grootte van cellen bij levende dieren in de loop van de tijd worden beschreven en gevalideerd tegen moeilijkere segmentatiemethoden. Er worden methoden beschreven die de controle van spierele elektrische en dus contractiele activiteit mogelijk maken. Verlies van skeletspiercontractiele activiteit verminderde de spiergroei sterk. Bij larven wordt een protocol beschreven dat herintroductie van patroongevoede elektrisch opgewekte contractiele activiteit mogelijk maakt. De beschreven methoden minimaliseren het effect van interindividuele variabiliteit en maken analyse mogelijk van het effect van elektrische, genetische, medicamenteuze of omgevingsstimuli op een verscheidenheid aan cellulaire en fysiologische groeiparameters in de context van het levende organisme. Langdurige follow-up van de gemeten effecten van een gedefinieerde interventie in het vroege leven op individuen kan vervolgens worden uitgevoerd.
Introduction
Gereguleerde weefselgroei, bestaande uit toename van het aantal cellen (hyperplasie) en /of celgrootte (hypertrofie), is een cruciale factor in ontwikkeling, regeneratie en ecologische en evolutionaire aanpassing. Ondanks de enorme vooruitgang in moleculair genetisch begrip van zowel cel- als ontwikkelingsbiologie in de afgelopen decennia, staat het mechanistische begrip van de regulatie van weefsel en orgaangrootte nog in de kinderschoenen. Een reden voor deze lacune in kennis is de moeilijkheid om weefselgroei in levende organismen te kwantificeren met de nodige ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid.
Verschillende aspecten van de groei van hele organismen kunnen herhaaldelijk in de loop van de tijd worden gemeten, waarbij groeicurven voor elk individu 1,2,3,4,5 worden onthuld. Steeds geavanceerdere scanmethoden, zoals dubbele röntgenabsorptie (DXA), computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), maken het mogelijk de groei van hele organen en andere lichaamsregio’s (bijvoorbeeld individueel geïdentificeerde skeletspieren) bij afzonderlijke individuen, zowel menselijke als in modelorganismen, te volgen 6,7,8,9,10 . Deze methoden hebben echter nog niet de resolutie om individuele cellen te onthullen en dus zijn de verbanden tussen cellulair gedrag en groei op weefselniveau moeilijk te onderscheiden. Om dergelijke verbanden te leggen, hebben traditionele studies vaak vertrouwd op cohorten van vergelijkbare individuele dieren, waarvan er een paar op opeenvolgende tijdstippen worden geofferd en vervolgens in cytologisch detail worden geanalyseerd. Dergelijke benaderingen vereisen het gemiddelde van de waargenomen veranderingen over groepen van (bij voorkeur vergelijkbare, maar niettemin variabele) individuen en lijden dus aan een gebrek aan temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het moeilijk is om gecorreleerde gebeurtenissen op cellulair niveau te vinden die wijzen op oorzaak en gevolg.
Studies op ongewervelde modelorganismen, aanvankelijk in C. elegans en D. melanogaster, hebben deze problemen omzeild door optische microscopie te ontwikkelen om cellulaire resolutie te bereiken en nauwkeurig de groei in de loop van de tijd te meten bij individuele individuen. Dergelijke studies hebben opvallend invariant cellijngedrag onthuld in de groei van deze kleine modelorganismen 11,12,13,14,15,16,17. Veel dieren, waaronder alle gewervelde dieren, hebben echter onbepaalde cellijnlijnen en beheersen weefselgroei door mysterieuze feedbackprocessen die dienen om het genetisch gecodeerde groeiprogramma om te zetten in een functioneel driedimensionaal organisme met al zijn samenstellende weefsels en organen die qua grootte op de juiste manier zijn afgestemd. Om deze complexe groeiprocessen te begrijpen, is het wenselijk om hele weefsels of organen in de loop van de tijd in afzonderlijke individuen in beeld te brengen die experimenteel kunnen worden gemanipuleerd door genetische, farmacologische of andere interventies op een tijdstip naar keuze en het effect vervolgens geanalyseerd.
Elke gewervelde skeletspier heeft een gedefinieerde grootte, vorm en functie, en goed gekarakteriseerde interacties met aangrenzende weefsels, zoals bot, pees en zenuwen. Sommige spieren zijn klein, liggen net onder de huid en zijn daarom goede kandidaten voor hoge resolutie beeldvormingsstudies. Net als de meeste organen groeit elke spier gedurende het embryonale, postnatale en juveniele leven, voordat het een stabiele volwassen grootte bereikt. Spieren hebben echter ook een uniek vermogen om van grootte te veranderen tijdens het volwassen leven, afhankelijk van gebruik en voeding18, en deze eigenschap heeft een grote invloed op de conditie van het organisme, sportprestaties en onafhankelijk leven. Verlies van spiermassa en functie op oudere leeftijd, sarcopenie, is een kwestie van toenemende zorg voor samenlevingen die worden geconfronteerd met een vergrijzende bevolkingvan 19,20,21.
Wij en anderen hebben ons gericht op de groei van gedefinieerde blokken skeletspierweefsel in het segmentaal herhalende lichaam van zebravislarven, als een schijnbaar gesloten systeem met enkele honderden cellen waarin weefselgroei, onderhoud en reparatie kunnen worden waargenomen en gemanipuleerd 22,23,24,25,26. Hoewel enig kwantitatief werk eerder is gemeld 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, is er geen gedetailleerde en gevalideerde methode beschikbaar voor het meten van spiergroei in cellulair detail in individuele gewervelde organismen in de loop van de tijd. Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het uitvoeren van dergelijke herhaalde metingen, samen met validatie, en een voorbeeld van het gebruik ervan om veranderingen in zowel hypertrofische als hyperplastische groei te analyseren als reactie op veranderde elektrische activiteit wordt gegeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier rapporteren we een methode voor een nauwkeurige en efficiënte schatting van het spiervolume van levende zebravislarven in stadia of in genetische varianten waarin pigmentatie geen grote belemmering vormt voor beeldvorming en wanneer voorbijgaande anesthesie en / of immobilisatie goed wordt verdragen. Terwijl we laserscanning confocale microscopie hebben gebruikt, zijn de beschreven benaderingen van toepassing op draaiende schijf confocale of lichtbladmicroscopie en op elke andere methode die stapels afbeeldingen op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn diep schatplichtig aan de inspanningen van Hughes-lableden Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin en Vladimir Snetkov voor de ontwikkeling van de beschreven protocollen, en aan Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau en Peter Currie voor het delen van plasmiden of zebravislijnen. SMH is een Medical Research Council (MRC) Scientist met Programme Grant G1001029, MR/N021231/1 en MR/W001381/1support. MA hield een MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship van King’s College London. Dit werk profiteerde van de goniometrische inbreng van David M. Robinson, geleerde, mentor en vriend.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
