Конвейер для исследования структур и сигнальных путей рецепторов сфингозин-1-фосфата

Сфингозин-1-фосфат (S1P), метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, представляет собой вездесущую лизофосфатидную сигнальную молекулу, которая включает в себя различные биологические активности, включая торговлю лимфоцитами, развитие сосудов, эндотелиальную целостность и частоту сердечных ^{сокращений 1,2,3}. S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через пять подтипов рецепторов S1P (S1PRs 1-5); S1PR встречаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения для последующих G-белков ^4,5. S1PR1 в первую очередь связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку цАМФ; S1PR2 и S1PR3 соединены с Gi, Gq и G12/13, а S1PR4 и S1PR5 передают сигнал через Gi и G12/13⁶.

Передача сигналов S1P-S1PR является критически важной терапевтической мишенью для нескольких заболеваний, включая аутоиммунные расстройства⁷, воспаление⁸, рак⁹ и даже COVID-19¹⁰. В 2010 году финголимод (FTY720) был лицензирован как первый в своем классе препарат, нацеленный на S1PR для лечения рецидивирующего рассеянного склероза (РС)¹¹. Тем не менее, он способен связываться со всеми S1PR, кроме S1PR2, в то время как неспецифическое связывание с S1PR3 приводит к отеку коры головного мозга, сужению сосудов и бронхов и утечке эпителия легких¹². В качестве альтернативной стратегии повышения терапевтической селективности были получены подтип-специфические лиганды для рецептора. Сипонимод (BAF312) был одобрен в 2019 году для лечения рецидивирующего рассеянного склероза¹³; он эффективно нацелен на S1PR1 и S1PR5, тогда как он не имеет сродства к S1PR3, проявляя меньше побочных эффектов в клинической практике¹⁴. В 2020 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США разрешило озанимод для терапии^{РС 15}. Сообщалось, что озанимод обладает в 25 раз большей селективностью для S1PR1, чем для S1PR5¹⁶. Примечательно, что в контексте нынешней пандемии COVID-19 было обнаружено, что агонистические препараты, нацеленные на S1PR, могут быть использованы для лечения COVID-19 с использованием методов иммуномодулирующей терапии¹⁷. По сравнению с финголимодом, озанимод показал превосходство в снижении симптомов у пациентов с COVID-19 и в настоящее время проходит клинические испытания¹⁰. Понимание структурной основы и функции S1PR закладывает значительную основу для разработки препарата, который избирательно нацелен на S1PRs¹⁸.

Многие методы используются для исследования структурной информации биомакромолекул, включая рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронную микроскопию (ЭМ). По состоянию на март 2022 года в банке данных белка (PDB) хранится более 180 000 структур, и большинство из них были разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии. Тем не менее, с первой структурой TPRV1 с почти атомным разрешением (разрешение 3,4 Å), о которой сообщили Ифань Чэн и Дэвид Джулиус в 2013^{году 19}, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала основным методом для белковых структур, и общее количество структур EM PDB составило более 10 000. Важнейшими областями прорыва являются разработка новых камер для визуализации, известных как камеры прямого обнаружения электронов, и новые алгоритмы обработки изображений. Крио-ЭМ произвел революцию в структурной биологии и структурно-ориентированном открытии лекарств за последнее десятилетие²⁰. Поскольку понимание того, как макромолекулярные комплексы выполняют свои сложные роли в живой клетке, является центральной темой в биологических науках, крио-ЭМ имеет потенциал для выявления конформаций динамических молекулярных комплексов, особенно для трансмембранных белков²¹. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим надсемейством трансмембранных белков и мишенью для более чем 30% продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов²². Разработка крио-ЭМ способствовала всплеску структур с высоким разрешением белковых комплексов GPCR-G, что позволяет определять структуры для «трудноизлечимых» мишеней, которые все еще недоступны для рентгеновского кристаллографического анализа в конструкции лекарственного средства²³. Следовательно, крио-ЭМ-приложение дает возможность определить трехмерную структуру GPCR в почти нативных условиях при близком к атомному разрешению²⁴. Достижения в области крио-ЭМ позволяют визуализировать механистические основы стимуляции или ингибирования GPCR, а также дополнительную пользу в раскрытии новых сайтов связывания для создания GPCR-таргетных лекарств²⁵.

Опираясь на огромные успехи крио-ЭМ технологии, мы недавно идентифицировали структуры агонизированных сигнальных комплексов S1PR1-, S1PR3- и S1PR5-Gi^26,27. У людей S1PR обнаруживаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения в отношении последующих G-белков ^4,5. S1PR1 в основном связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку 3′,5′-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). S1PR3 и S1PR5 также способны сцепляться с Gi ^6,28. Поскольку активация Gi-связанных рецепторов снижает выработку цАМФ²⁹, был введен анализ Ги-ингибирования цАМФ для измерения эффектов ингибирования цАМФ для захвата функциональных изменений ^26,27. Используя мутантную версию люциферазы Photinus pyralis, в которую был вставлен цАМФ-связывающий фрагмент белка, этот анализ цАМФ предлагает простой и надежный метод мониторинга активности GPCR через изменения внутриклеточной концентрации цАМФ³⁰. Он представляет собой чувствительный и нерадиоактивный функциональный анализ и может применяться для мониторинга нисходящей сигнализации в режиме реального времени широкого спектра GPCR для целей обнаружения лекарств³¹.

Здесь приводится краткое изложение критических методов разрешения режимов активации и распознавания лекарств S1PR, в первую очередь включая крио-ЭМ-манипуляции и анализ Ги-ингибирования цАМФ. Целью этой статьи является предоставление всестороннего экспериментального руководства для дальнейших исследований структур и функций GPCR.