Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Sphingosin-1-phosphat (S1P), ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist ein ubiquitäres lysophosphatidisches Signalmolekül, das verschiedene biologische Aktivitäten umfasst, einschließlich Lymphozytentransport, vaskuläre Entwicklung, endotheliale Integrität und Herzfrequenz ^1,2,3. S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen durch fünf S1P-Rezeptor-Subtypen (S1PRs 1-5); S1PRs kommen in einer Vielzahl von Geweben vor und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine ^4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die cAMP-Produktion hemmt; S1PR2 und S1PR3 sind mit Gi, Gq und G12/13 gekoppelt, und S1PR4 und S1PR5 übertragen Signale über Gi und G12/13⁶.

Die S1P-S1PR-Signalübertragung ist ein kritisches therapeutisches Ziel für mehrere Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen⁷, Entzündungen⁸, Krebs⁹ und sogar COVID-19¹⁰. Im Jahr 2010 wurde Fingolimod (FTY720) als First-in-Class-Medikament gegen S1PRs zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)¹¹ zugelassen. Es ist jedoch in der Lage, an alle S1PRs außer S1PR2 zu binden, während eine unspezifische Bindung an S1PR3 zu Ödemen der Großhirnrinde, Gefäß- und Bronchialverengung und Lungenepithelleckage führt¹². Als alternative Strategie zur Erhöhung der therapeutischen Selektivität wurden subtypspezifische Liganden für den Rezeptor hergestellt. Siponimod (BAF312) wurde 2019 für die rezidivierende MS-Behandlung zugelassen¹³; Es zielt effektiv auf S1PR1 und S1PR5 ab, während es keine Affinität zu S1PR3 hat und in der klinischen Praxis weniger Nebenwirkungen aufweist¹⁴. Im Jahr 2020 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration Ozanimod für die MS-Therapie¹⁵. Es wurde berichtet, dass Ozanimod eine 25-fach höhere Selektivität für S1PR1 als für S1PR5¹⁶ aufweist. Insbesondere wurde im Zusammenhang mit der aktuellen COVID-19-Pandemie entdeckt, dass agonistische Medikamente, die auf S1PRs abzielen, zur Behandlung von COVID-19 unter Verwendung immunmodulatorischer Therapietechniken eingesetzt werden können¹⁷. Im Vergleich zu Fingolimod hat Ozanimod eine Überlegenheit bei der Senkung der Symptome bei COVID-19-Patienten gezeigt und befindet sich nun in klinischen Studien¹⁰. Das Verständnis der strukturellen Basis und Funktion von S1PRs legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments, das selektiv auf S1PRs¹⁸ abzielt.

Viele Techniken werden verwendet, um die Strukturinformationen von Biomakromolekülen zu untersuchen, einschließlich Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Elektronenmikroskopie (EM). Mit Stand März 2022 sind mehr als 180.000 Strukturen in der Protein Databank (PDB) hinterlegt, von denen die meisten durch Röntgenkristallographie aufgelöst wurden. Mit der ersten nahezu atomaren Auflösungsstruktur von TPRV1 (3,4 Å Auflösung), die Yifan Cheng und David Julius 2013¹⁹ berichteten, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Mainstream-Technik für Proteinstrukturen geworden, und die Gesamtzahl der EM-PDB-Strukturen betrug mehr als 10.000. Die entscheidenden Durchbruchsbereiche sind die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektionskameras bekannt sind, und neue Bildverarbeitungsalgorithmen. Kryo-EM hat die Strukturbiologie und die strukturbasierte Wirkstoffforschung in den letzten zehn Jahren revolutioniert²⁰. Da das Verständnis, wie makromolekulare Komplexe ihre komplizierten Rollen in der lebenden Zelle erfüllen, ein zentrales Thema in den biologischen Wissenschaften ist, hat Kryo-EM das Potenzial, Konformationen dynamischer Molekülkomplexe aufzudecken, insbesondere für Transmembranproteine²¹. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Superfamilie von Transmembranproteinen und die Ziele von mehr als 30% der derzeit vermarkteten Arzneimittel²². Die Entwicklung von Kryo-EM hat zu einem Ausbruch hochauflösender Strukturen von GPCR-G-Proteinkomplexen beigetragen, was die Strukturbestimmung für “hartnäckige” Ziele ermöglicht, die für die röntgenkristallographische Analyse im Arzneimitteldesign noch nicht zugänglich sind²³. Daher bietet die Kryo-EM-Anwendung die Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von GPCRs unter nahezu nativen Bedingungen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen²⁴. Fortschritte in der Kryo-EM ermöglichen es, mechanistische Grundlagen der GPCR-Stimulation oder -Hemmung zu visualisieren und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der neuartigen Bindungsstellen für die GPCR-zielgerichtete Arzneimittelherstellung^{zu erzielen 25}.

Gestützt auf die enormen Fortschritte der Kryo-EM-Technologie haben wir kürzlich Strukturen von gequälten S1PR1-, S1PR3- und S1PR5-Gi-Signalkomplexen identifiziert^26,27. Beim Menschen werden S1PRs in verschiedenen Geweben gefunden und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine ^4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die Produktion von 3′,5′-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmt. S1PR3 und S1PR5 können auch mit Gi ^6,28 gekoppelt werden. Da die Gi-gekoppelte Rezeptoraktivierung die Produktion von cAMP²⁹ verringert, wurde ein Gi-Inhibition cAMP-Assay eingeführt, um cAMP-Hemmungseffekte zur Erfassung funktioneller Veränderungen zu messen^26,27. Unter Verwendung einer mutierten Version von Photinus pyralis luciferase, in die ein cAMP-bindendes Proteinteil eingefügt wurde, bietet dieser cAMP-Assay eine einfache und zuverlässige Methode zur Überwachung der GPCR-Aktivität durch Änderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration³⁰. Es handelt sich um einen empfindlichen und nicht radioaktiven funktionellen Assay, der zur Überwachung der nachgeschalteten Echtzeitsignalisierung einer Vielzahl von GPCRs für die Wirkstoffforschung eingesetzt werden^{kann 31}.

Hier wird eine Zusammenfassung der kritischen Methoden zur Auflösung der Aktivierungs- und Arzneimittelerkennungsmodi von S1PRs gegeben, hauptsächlich einschließlich Kryo-EM-Manipulationen und eines Gi-Inhibition cAMP-Assays. Dieser Artikel zielt darauf ab, umfassende experimentelle Leitlinien für weitere Untersuchungen der Strukturen und Funktionen von GPCRs bereitzustellen.