خط أنابيب للتحقيق في الهياكل ومسارات الإشارات لمستقبلات سفينغوزين 1-فوسفات

Sphingosine-1-phosphate (S1P) ، وهو منتج استقلابي من الدهون السفينغولية في غشاء الخلية ، هو جزيء إشارات ليسوفوسفاتيدي في كل مكان يتضمن أنشطة بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك الاتجار بالخلايا الليمفاوية ، وتطور الأوعية الدموية ، والسلامة البطانية ، ومعدل ضربات القلب¹،^2،3. يمارس S1P آثاره الفسيولوجية المتنوعة من خلال خمسة أنواع فرعية من مستقبلات S1P (S1PRs 1-5) ؛ تم العثور على S1PRs في مجموعة متنوعة من الأنسجة وتظهر تفضيلات فريدة لبروتينات G المصب ^4,5. يقترن S1PR1 في المقام الأول ببروتين Gi ، الذي يمنع لاحقا إنتاج cAMP ؛ يقترن S1PR2 و S1PR3 ب Gi و Gq و G12/13 ، و S1PR4 و S1PR5 ينقلان الإشارة من خلال Gi و G12/13⁶.

تعد إشارات S1P-S1PR هدفا علاجيا حاسما لأمراض متعددة ، بما في ذلك اضطرابات المناعة الذاتية⁷ والالتهاب⁸ والسرطان⁹ وحتى COVID-19¹⁰. في عام 2010 ، تم ترخيص fingolimod (FTY720) كأول دواء في فئته يستهدف S1PRs لعلاج التصلب المتعدد الانتكاسي (MS)¹¹. ومع ذلك ، فهو قادر على الارتباط بجميع S1PRs باستثناء S1PR2 ، في حين أن الارتباط غير المحدد ب S1PR3 يؤدي إلى وذمة القشرة الدماغية ، وانقباض الأوعية الدموية والشعب الهوائية ، والتسرب الظهاري الرئوي¹². كاستراتيجية بديلة لزيادة الانتقائية العلاجية ، تم إنتاج روابط خاصة بالنوع الفرعي للمستقبلات. تمت الموافقة على Siponimod (BAF312) في عام 2019 لعلاج التصلب المتعدد الانتكاسي¹³ ؛ يستهدف بشكل فعال S1PR1 و S1PR5 ، في حين أنه ليس لديه تقارب مع S1PR3 ، مما يدل على آثار جانبية أقل في الممارسة السريرية¹⁴. في عام 2020 ، أذنت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ب ozanimod لعلاج مرض التصلب العصبي المتعدد¹⁵. وقد أفيد أن أوزانيمود يحمل انتقائية أكبر بمقدار 25 ضعفا ل S1PR1 مقارنة ب S1PR5¹⁶. والجدير بالذكر أنه في سياق جائحة COVID-19 الحالية ، تم اكتشاف أن الأدوية الناهضة التي تستهدف S1PRs يمكن استخدامها لعلاج COVID-19 باستخدام تقنيات العلاج المناعي¹⁷. بالمقارنة مع فينجوليمود ، أظهر أوزانيمود تفوقا في خفض الأعراض لدى مرضى COVID-19 ويخضع الآن للتجارب السريرية¹⁰. إن فهم الأساس الهيكلي ووظيفة S1PRs يضع أساسا مهما لتطوير دواء يستهدف بشكل انتقائي S1PRs¹⁸.

تستخدم العديد من التقنيات للتحقيق في المعلومات الهيكلية للجزيئات الحيوية الكبيرة ، بما في ذلك علم البلورات بالأشعة السينية ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، والمجهر الإلكتروني (EM). اعتبارا من مارس 2022 ، هناك أكثر من 180،000 هيكل مودع في بنك بيانات البروتين (PDB) ، وقد تم حل معظمها عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. ومع ذلك ، مع أول بنية دقة شبه ذرية ل TPRV1 (دقة 3.4 Å) التي أبلغ عنها Yifan Cheng و David Julius في 2013¹⁹ ، أصبح المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) تقنية سائدة لهياكل البروتين ، وكان العدد الإجمالي لهياكل EM PDB أكثر من 10000. تتمثل مجالات الاختراق الحاسمة في تطوير كاميرات جديدة للتصوير تعرف باسم كاميرات الكشف المباشر عن الإلكترونات وخوارزميات معالجة الصور الجديدة. أحدثت Cryo-EM ثورة في بيولوجيا البنية واكتشاف الأدوية القائمة على البنية في العقد الماضي²⁰. نظرا لأن فهم كيفية قيام المجمعات الجزيئية الكبيرة بأدوارها المعقدة في الخلية الحية هو موضوع مركزي في العلوم البيولوجية ، فإن cryo-EM لديه القدرة على الكشف عن تكوينات المجمعات الجزيئية الديناميكية ، خاصة بالنسبة للبروتينات عبر الغشاء²¹. مستقبلات G-protein المقترنة (GPCRs) هي أكبر عائلة فائقة من البروتينات عبر الغشاء وأهداف أكثر من 30٪ من المستحضرات الصيدلانية المسوقة حاليا²². ساهم تطوير cryo-EM في انفجار الهياكل عالية الدقة لمجمعات بروتين GPCR-G ، مما مكن من التحديد الهيكلي للأهداف “المستعصية” التي لا تزال غير متاحة للتحليل البلوري بالأشعة السينية في تصميم الأدوية²³. وبالتالي ، يوفر تطبيق cryo-EM فرصة لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد ل GPCRs في ظروف قريبة من الأصل بالقرب من الدقة الذرية²⁴. إن التقدم في مجال التبريد الكهرومغناطيسي يجعل من الممكن تصور الأسس الميكانيكية لتحفيز GPCR أو تثبيطه ، والاستفادة بشكل أكبر في الكشف عن مواقع الربط الجديدة لإنشاء الأدوية المستهدفة GPCR²⁵.

بالاعتماد على الخطوات الهائلة لتقنية cryo-EM ، حددنا هياكل مجمعات إشارات S1PR1 و S1PR3 و S1PR5-Gi المؤلمة مؤخرا^26,27. في البشر ، توجد S1PRs في أنسجة مختلفة وتظهر تفضيلات فريدة لبروتينات G ^4,5 في المراحل النهائية. يقترن S1PR1 في المقام الأول ببروتين Gi ، الذي يمنع لاحقا إنتاج أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري 3 ′ ، 5 ′ (cAMP). S1PR3 و S1PR5 قادران أيضا على الاقتران مع Gi ^6,28. نظرا لأن تنشيط مستقبلات Gi-pair يقلل من إنتاج cAMP²⁹ ، فقد تم إدخال فحص cAMP لتثبيط Gi لقياس تأثيرات تثبيط cAMP لالتقاط التعديلات الوظيفية^26,27. باستخدام نسخة متحولة من Photinus pyralis luciferase حيث تم إدخال بروتين ملزم ل cAMP ، يوفر فحص cAMP هذا طريقة بسيطة وموثوقة لمراقبة نشاط GPCR من خلال التغيرات في تركيز cAMP^{داخل الخلايا 30}. وهو اختبار وظيفي حساس وغير مشع ويمكن تطبيقه لمراقبة الإشارات النهائية في الوقت الحقيقي لمجموعة واسعة من GPCRs لأغراض اكتشاف الأدوية³¹.

هنا ، يتم تقديم ملخص للطرق الحاسمة في حل طرق التنشيط والتعرف على الأدوية ل S1PRs ، بما في ذلك في المقام الأول التلاعب بالتبريد EM وفحص cAMP المثبط Gi. تهدف هذه المقالة إلى توفير إرشادات تجريبية شاملة لمزيد من الاستكشافات في هياكل ووظائف GPCRs.