Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

La sphingosine-1-phosphate (S1P), un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est une molécule de signalisation lysophosphatique omniprésente qui implique diverses activités biologiques, y compris le trafic de lymphocytes, le développement vasculaire, l’intégrité endothéliale et la fréquence cardiaque ^1,2,3. Le S1P exerce ses divers effets physiologiques par l’intermédiaire de cinq sous-types de récepteurs S1P (S1PRs 1-5); Les S1PR se trouvent dans une variété de tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval ^4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’AMPc; S1PR2 et S1PR3 sont couplés avec Gi, Gq et G12/13, et S1PR4 et S1PR5 transduisent le signal via Gi et G12/13⁶.

La signalisation S1P-S1PR est une cible thérapeutique essentielle pour de multiples maladies, notamment les maladies auto-immunes⁷, l’inflammation⁸, le cancer⁹ et même la COVID-19¹⁰. En 2010, le fingolimod (FTY720) a été homologué en tant que médicament de première classe ciblant les RP S1 pour traiter la sclérose en plaques (SEP)¹¹. Cependant, il est capable de se lier à tous les S1PR sauf S1PR2, tandis que la liaison non spécifique à S1PR3 entraîne un œdème du cortex cérébral, une constriction vasculaire et bronchique et une fuite épithéliale^{pulmonaire 12}. Comme stratégie alternative pour augmenter la sélectivité thérapeutique, des ligands spécifiques au sous-type pour le récepteur ont été produits. Le siponimod (BAF312) a été approuvé en 2019 pour le traitement de la SEP en rechute¹³; il cible efficacement S1PR1 et S1PR5, alors qu’il n’a aucune affinité pour S1PR3, présentant moins d’effets secondaires dans la pratique clinique¹⁴. En 2020, la Food and Drug Administration des États-Unis a autorisé l’ozanimod pour le traitement de la SEP¹⁵. Il a été rapporté que l’ozanimod détient une sélectivité 25 fois plus grande pour S1PR1 que pour S1PR5¹⁶. Notamment, dans le contexte de la pandémie actuelle de COVID-19, il a été découvert que des médicaments agonistes ciblant les RP S1 peuvent être utilisés pour traiter la COVID-19 en utilisant des techniques de thérapie immunomodulatrice¹⁷. En comparaison avec le fingolimod, l’ozanimod a montré sa supériorité dans la réduction des symptômes chez les patients atteints de COVID-19 et fait actuellement l’objet d’essais cliniques¹⁰. Comprendre la base structurelle et la fonction des RP S1 jette des bases importantes pour le développement d’un médicament qui cible sélectivement les PR^{S11 18}.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier l’information structurelle des biomacromolécules, y compris la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie électronique (EM). En mars 2022, plus de 180 000 structures ont été déposées sur la banque de données sur les protéines (PDB), et la plupart d’entre elles ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Cependant, avec la première structure de résolution quasi atomique de TPRV1 (résolution de 3,4 Å) rapportée par Yifan Cheng et David Julius en 2013 19, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est devenue une technique courante pour les structures protéiques, et le nombre total de structures EM PDB était supérieur à¹⁰ 000. Les domaines de percée critiques sont le développement de nouvelles caméras pour l’imagerie connues sous le nom de caméras de détection directe d’électrons et de nouveaux algorithmes de traitement d’image. Cryo-EM a révolutionné la biologie des structures et la découverte de médicaments basés sur la structure au cours de la dernière décennie²⁰. Comme comprendre comment les complexes macromoléculaires remplissent leurs rôles complexes dans la cellule vivante est un thème central en sciences biologiques, la cryo-EM a le potentiel de révéler des conformations de complexes moléculaires dynamiques, en particulier pour les protéines transmembranaires²¹. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande superfamille de protéines transmembranaires et les cibles de plus de 30 % des produits pharmaceutiques actuellement commercialisés²². Le développement de la cryo-EM a contribué à une explosion de structures à haute résolution de complexes protéiques GPCR-G, permettant la détermination structurelle de cibles « réfractaires » qui ne sont toujours pas accessibles à l’analyse cristallographique aux rayons X dans la conception de médicaments²³. Par conséquent, l’application cryo-EM offre une chance de déterminer la structure tridimensionnelle des RCPG dans des conditions quasi natives à une résolution atomique proche de²⁴. Les progrès de la cryo-EM permettent de visualiser les fondements mécanistes de la stimulation ou de l’inhibition des RCPG, et d’autres avantages dans la découverte de nouveaux sites de liaison pour la création de médicaments ciblant les RCPG²⁵.

En nous appuyant sur les énormes progrès de la technologie cryo-EM, nous avons identifié des structures de complexes de signalisation agonisés S1PR1-, S1PR3- et S1PR5-Gi récemment^26,27. Chez l’homme, les S1PR se trouvent dans divers tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval ^4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’adénosine monophosphate 3′,5′-cyclique (AMPc). S1PR3 et S1PR5 sont également capables de se coupler avec Gi ^6,28. Étant donné que l’activation des récepteurs gicouplés diminue la production d’AMPc²⁹, un test d’inhibition de l’AMPc de Gi a été introduit pour mesurer les effets d’inhibition de l’AMPc pour capturer les altérations fonctionnelles^26,27. Utilisant une version mutante de Photinus pyralis luciferase dans laquelle une fraction protéique de liaison à l’AMPc a été insérée, ce test d’AMPc offre une méthode simple et fiable pour surveiller l’activité des RCPG par des changements dans la concentration intracellulaire d’AMPc³⁰. Il s’agit d’un essai fonctionnel sensible et non radioactif qui peut être appliqué pour surveiller la signalisation en aval en temps réel d’un large éventail de RCPG à des fins de découverte de médicaments³¹.

Ici, un résumé est fourni des méthodes critiques pour résoudre les modes d’activation et de reconnaissance des médicaments des S1PR, y compris principalement des manipulations cryo-EM et un test d’AMPc d’inhibition de Gi. Cet article vise à fournir des conseils expérimentaux complets pour d’autres explorations des structures et des fonctions des RCPG.