בדיקת CAM-Delam לציון תכונות גרורתיות על ידי כימות דלמינציה ויכולת פלישה של תאים סרטניים

בקצרה, איור 1 מסכם את השלבים הכוללים בבדיקת CAM-Delam. הפרוטוקול שלהלן מבוסס על 30 ביצי תרנגולות מופרות בתרבית ושימוש בשני קווי תאים סרטניים שונים שנזרעו בנפרד בשלוש טבעות/ביצה ונותחו בארבע נקודות זמן. 1. דגירה של ביצים השתמשו בביצים מופרות של אפרוחים מדגרה מקומית, המבטיחות הפריה של יותר מ-90%הערה: הביצים לא היו צריכות להיות מאוחסנות במשך יותר מ -4 ימים בטמפרטורת החדר (RT). בשוודיה, אישור אתי לשימוש ניסיוני בתרנגולות עובריות נדרש רק מהיום העוברי (E) 14 ואילך. במידת הצורך, נגבו בזהירות מכנית כל לכלוך או נוצה על הביצים באמצעות מגבת נייר יבשה או רטובים במים. נקו ועקרו את אינקובטור הביצים עם 70% אתנול לפני השימוש (בכל פעם). הניחו את מספר הביצים הרצוי במגשי ביצים ודגרו את ביצי האפרוח בצורה אופקית באינקובטור ביצים בטמפרטורה של 37.5-38 מעלות צלזיוס עם לחות של 70%. קחו את זה כעל יום הדגירה 0 (איור 1A). 2. הכנת סירת שקילה, קופסאות פלסטיק ומכשירי דיסקציה השתמשו ב-70% אתנול כדי לעקר 30 סירות שקילה וב-30 קופסאות פלסטיק קטנות (כ-0.4 ליטר) עם כובעים שקופים. מייבשים את סירות השקילה והקופסאות במכסה מנוע למינרי למשך הלילה (ON) ומאחסנים בקופסת פלסטיק סגורה עד לשימוש נוסף ביום הדגירה 3. לעקר 2 ליטר של H מזוקק או deionized H2O לכל 30 ביצים דגירה. לעקר שני זוגות מספריים ושלושה זוגות מלקחיים על ידי ריסוס 70% אתנול. מייבשים את המכשירים באוויר ואז מאחסנים אותם בקופסה מעוקרת עד ליום הדגירה 3.הערה: פעולות אלה (שלבים 2.1-2.4) יכולות להיעשות בכל יום לפני יום הדגירה 3. השתמש בכפפות כדי למנוע זיהום. 3. פותחים את הביצים ומעבירים לתא הלח הפנימי הערה: השתמש בכפפות ובמסכת פנים כדי למנוע זיהום. מוסיפים כ-50 מ”ל של H2O מעוקר לקופסאות הפלסטיק המעוקרות. שמור את הקופסאות מלאות המים עם מכסים סגורים, כדי למנוע זיהום, ב- RT עד לשימוש. ביום הדגירה 3, לפצח את קליפת הביצה באמצעות החלק החד של המספריים ולחתוך פתח ישר בקליפה. לשבור באופן ידני את קליפת הביצה מעל סירת שקילה ולאסוף את חלבון הביצה, החלמון והעובר הבריא המחובר אליו בסירת השקילה (איור 1B). חפשו עובר שלם עם לב פועם, חלמון שלם וכלי דם מפותחים לניסוי (>95% מהביציות המדגרות). השליכו ביציות עם עובר מעוות, עובר ללא לב פועם, חלמון ביצה שבור או כלי דם פגומים של חלמון. מעבירים בעדינות את סירת השקילה לחדר לחות פנימי.הערה: עבור שלבים 3.2.-3.4., עבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע זיהום, ואם אפשר, השתמש במכסה מנוע למינרי. דגירה של החדר הלח הפנימי באינקובטור הביצים (איור 1C). תרבית את הביצים ללא קליפות מהיום ה-3 עד היום ה-10 באינקובטור הביצים לפני השימוש בהן (ראו שלב 3.6),ובעת הצורך, הוסיפו מים לחממה כדי לשמור על לחות של 70%. בדקו את התאים הלחים הפנימיים דרך מכסה הפלסטיק השקוף לאיתור עוברים מתים או ביציות מזוהמות ללא קליפה מדי יום, והסירו אותם מהאינקובטור. 4. הכנת טבעות סיליקון כדי להכין טבעות סיליקון, חותכים צינור סיליקון בקוטר פנימי וחיצוני של 4 מ”מ ו-5 מ”מ, בהתאמה, בעובי של כ-1 מ”מ, רצוי באמצעות חותך נייר (איור 1D). מעבירים את טבעות הסיליקון לבקבוקי זכוכית קטנים (איור 1D), מכסים בנייר כסף מתכת ומעקרים אותן באמצעות אוטוקלאב או דומה.הערה: הימנעו מבדיקות אוטוקלאב חוזרות ונשנות של טבעות סיליקון שאינן בשימוש שעלולות להיות מזוהמות, שכן טיפול כזה מקטין את הקיבולת של טבעות הסיליקון להיצמד לממברנה, עם דליפה נוספת של תמיסת התא הסרטני/קולגן/RPMI מחוץ לטבעות. אחסנו את טבעות הסיליקון הסטריליות ב-RT.הערה: ניתן לבצע שלב זה בכל יום לפני יום הדגירה 10. 5. הכנת תאים סרטניים הערה: תמיסות כגון מדיום תרבית תאים, טריפסין ו-1x PBS מאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ויש לחמם אותן ל-37 מעלות צלזיוס באמבטיית מים לפני הוספתן לתאים. לאחר החימום יש לשטוף את הבקבוקים ב-70% אתנול ולייבש לפני השימוש. תרבית את קווי העניין של התאים הסרטניים במדיום התרבית הרלוונטי בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% (v/v) CO2.הערה: כאן, U251-GFP גליובלסטומה ותאי סרטן ערמונית PC-3U-GFP עברו תרבית במדיום RPMI בינוני-RPMI שלם בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין (PS). תכנן את תרבית התאים הסרטניים כך שכ-50 × 106 תאים סרטניים יהיו מוכנים לקציר ביום הדגירה 10 של בדיקת CAM-Delam. שנה את מדיום תרבית התאים כל 2-3 ימים, או כאשר הצבע הבינוני משתנה מוורוד לכתום/צהוב. אופציונלי: לגרום להיפוקסיה על ידי טיפול בתאים הסרטניים באמצעות CoCl2 כדי לחקור את ההשפעות המכניסטיות המולקולריות על דלאנציה יום אחד לפני קצירת התאים.אזהרה: ל-CoCl2 יש רעילות מתונה. טפלו בזהירות במכסה אדים, ועקבו אחר הוראות היצרן. הכן תמיסת מלאי טרייה של 20 mM CoCl2 על ידי המסת 0.0258 גרם ב-10 מ”ל של H20 מזוקק מעוקר בצינור חרוטי 15 מ”ל עטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. בצינור חרוטי של 50 מ”ל, יש לערבב 250 μL של תמיסת המניות CoCl 2 של 20 mM CoCl2 ב-25 מ”ל של מדיום RPMI בתוספת 1% (v/v) PS (אך ללא FBS) לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס”מ. מערבולת בעדינות. הסר את מדיום ה-RPMI המלא ממנות תרביות התאים. לשטוף את התאים עם מעוקר 1x PBS 2x. הוסף 25 מ”ל של מדיום RPMI עם טריפסיניזציה של 200 μM CoCl2 (ראה שלב 5.6). ביום 10 של דגירה של ביצים, הכינו 1 מ”ל של תערובת קולגן/RPMI (יחס של 1:3), המכילה 250 μL של קולגן מסוג I (5 מ”ג/מ”ל) ו-750 μL של מדיום RPMI מתרבית תאים בתוספת 10% FBS ו-1% (v/v) PS. שמרו את תערובת הקולגן/RPMI על הקרח. נסה את התאים הסרטניים לבודד את התאים על ידי הסרת מדיום תרביות התאים תחילה ושטיפת 2x עם 1x PBS. מוסיפים 3 מ”ל של תמיסת טריפסין (0.05%) לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס”מ ומדגרים במשך 2-3 דקות בחממת תרביות תאים עד שהתאים מתנתקים. השתמש במיקרוסקופ הפוך עם ראש טבלה כדי לראות את התאים המנותקים. במידת הצורך, הקש בעדינות על צד הבקבוקון כדי לנתק תאים שנותרו מקובצים או מחוברים לאשכולות. השביתו את הטריפסין על ידי הוספת 5 מ”ל של מדיום RPMI שלם לכל צלחת תרבית תאים ואספו את תרחיף התאים מכל מנות תרביות התאים לצינור של 50 מ”ל. ספרו את התאים הסרטניים בשיטת ההדרה של Tripan Blue כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים באמצעות מונה תאים. הוסיפו 10 μL של תרחיף התא ל-10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן. מערבבים את הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן טוענים 10 μL של תערובת התאים לכל תא לתוך שקופית הדגימה במונה התא. חזור על ספירת תאים פי 3 כדי לאמת את מספר התא/מ”ל. חישוב וצנטריפוגה של תרחיף תרבית התאים בנפח הנכון המכיל 50 x 106 תאים סרטניים חיים בצינור 50 מ”ל ב-500 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט וערבבו את גלולת התא עם 1 מ”ל של תערובת הקולגן/RPMI. מכיוון שקולגן הוא חומר ג’לטיני, ערבבו את התאים לאט ובזהירות רבה עם פיפטה של 1 מ”ל כדי למנוע אובדן תאים ביצירת בועות. שמור את תרחיף התא המוכן על הקרח והביא אותו לאזור העבודה של הביצה.הערה: הימנעו מלהשאיר את התאים הסרטניים המוכנים על הקרח במשך זמן רב מדי. יש להניח את התאים הסרטניים המוכנים על ה- CAM תוך 15-25 דקות. 6. זריעת התאים הסרטניים על ה-CAM הערה: השתמש בכפפות ובמסכת פנים כדי למנוע זיהום. ביום הדגירה ה-10, מוציאים את התאים הלחים הפנימיים עם הביצים נטולות הקליפות המדגרות מהאינקובטור.הערה: ניתן להשתמש בכ-90% מהמספר ההתחלתי של הביצים המדגרות; ראו איור 2. פתחו את התא הפנימי והניחו עד שש טבעות סיליקון על ה-CAM באמצעות מלקחיים מעוקרים.הערה: הימנע מהנחת טבעות הסיליקון זו ליד זו או קרוב לכלי דם גדולים יותר. ערבבו את תרחיף התא הסרטני על ידי צנרת כדי לקבל חלוקה שווה של תאים סרטניים, והוסיפו 20 μL (1 × 106 תאים) של תרחיף התא הסרטני המוכן בתוך טבעת סיליקון (איור 1E). בעת הוספת התאים, שמור את קצה הפיפטה מעל ה- CAM כדי לוודא שלא תפגע בקרום.הערה: על פי ממצאים קודמים7, ניתן לזרוע תאים סרטניים שונים בטבעות נפרדות על אותה CAM. סגור את החדר הלח הפנימי והכניס אותו לחממת הביצים. 7. בידוד של ה- CAM עם תאים סרטניים הקשורים לאחר 14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימי דגירה, מוציאים כשבעה תאים פנימיים לחים ופותחים את המכסים בזה אחר זה. בעזרת זוג מספריים, נתחו את התאים הסרטניים בתרבית המחוברים ל-CAM (מה שמכונה דגימות CAM-Delam) על ידי חיתוך מחוץ לטבעת הסיליקון (איור 1F). מעבירים באופן מיידי את דגימת CAM-Delam המבודדת באמצעות מלקחיים ל-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.1 M מאגר פוספט (PB) בצלחת פטרי לקיבוע הרקמה. יש לשמור על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.הערה: אחסן פתרון PFA של 4% בטמפרטורה של 4 °C (75 °F) למשך 5 ימים לכל היותר. אזהרה: PFA הוא רעיל. כשאתם מטפלים באבקת PFA ובפתרונות PFA, השתמשו במכסה אדים ועטו מסכת פנים וכפפות. הימנעו משאיפת אבקה או אדי תמיסה. בצע את הוראות היצרן. ערפו את עוברי התרנגולות והשליכו כפסולת ביולוגית בפחים ספציפיים. הסר את פתרון ה- PFA של 4% והוסף 30% סוכרוז ב- 0.1 M PB לדגימות CAM-Delam ושיווי משקל ב- 4 ° C למשך שעה אחת. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את טבעת הסיליקון באמצעות מלקחיים. בעזרת זוג מספריים, חתכו את דגימת CAM-Delam בצורה מלבנית עם התאים הסרטניים באמצע (איור 1G). בעזרת זוג מלקחיים, העבירו את דגימות ה-CAM-Delam למדיום חתך קפוא בצלחת פטרי כדי להסיר עודפי סוכרוז ולאחר מכן להטמעת תבניות במדיום חתך קפוא. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את דגימת CAM-Delam בצורת U בכיוון אנכי בתבניות ההטבעה באמצעות כל מכשיר דמוי מחט (איור 1G). הקפיאו ואחסנו את הדוגמאות של CAM-Delam בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. 8. חלוקת דוגמאות CAM-Delam חלקו את דגימות CAM-Delam הקפואות ב-10 מיקרומטר ב-5-6 שקופיות עוקבות באמצעות cryosectioning. אחסן את השקופיות עם מקטעים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס או השתמש ישירות לצביעת אימונוהיסטוכימיה. 9. צביעת אימונוהיסטוכימיה הביאו את השקופיות מ-−80 מעלות צלזיוס ל-RT למשך 5 דקות לפני שתתחילו את האימונופרוטוקול. צור קו עם סמן הידרופובי על השקופיות שבהן מסתיימים המקטעים. תנו להם להתייבש במשך כמה דקות. מניחים את השקופיות בתא לח (H2O) ומכסים את החלקים בכ-200-500 μL של תמיסת חסימה (10% סרום עגל עוברי ו-0.1% נתרן אזיד במי מלח עם 0.1% Triton X-100 [TBST]) ודגירה למשך 15-30 דקות.הערה: משלב זה ואילך, אל תתנו לשקופיות להתייבש בכל עת. שפכו את תמיסת החסימה והחליפו אותה ב-100-150 μL של הנוגדן העיקרי בעל העניין המדולל בתמיסה החוסמת ודגירה ON בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. רצוי להשתמש בנוגדן ארנב נגד למינין-111 כדי להגדיר את הלמינה הבסיסית יחד עם סמן תאי סרטן, אם לא באמצעות GFP או קווי תאים סרטניים אחרים המתויגים בפלואורסצנט.הערה: כאן, ארנב אנטי פון וילברנד פקטור שימש גם כדי לזהות כלי דם ב- CAM. הכינו שלוש קוביות זכוכית מלאות במאגר TBST. יוצקים את תמיסת הנוגדנים העיקרית, מעבירים את המגלשות לקובטות הזכוכית, ושוטפים לפחות 3x למשך 5 דקות כל אחת ב-TBST. הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה. כסו את המגלשה ב-100-150 μL של נוגדן פלואורסצנטי משני מתאים המדולל בתמיסת חסימה בשילוב עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI) ודגירה בחושך ב-RT למשך שעה אחת. יוצקים את תמיסת הנוגדנים המשנית, מעבירים את השקופיות לקובטות הזכוכית, ושוטפים לפחות 3x למשך 5 דקות כל אחת ב-TBST. הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה. הרכיבו את המגלשות על ידי הצבת 1-2 טיפות של מדיום הרכבה פלואורסצנטית על המגלשה, והניחו בעדינות מכסה זכוכית, תוך הימנעות מבועות אוויר. תן לשקופיות להתייבש במשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח, ואחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C (6 °F). 10. הדמיה מיקרוסקופית וניקוד דלמינציה צלמו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית, רצוי בהגדלה של פי 10 (איור 1H). נתחו את המקטעים באמצעות קטגוריות הניקוד הבאות של CAM-Delam (איור 3): חפשו למינה בסיסית שלמה ללא שינויים נראים לעין. חפשו את הלמינה הבסיסית המשתנה אך לא פגומה. חפשו את הלמינה הבסיסית הפגומה ללא פלישת תאים. חפשו למינה בסיסית פגומה עם פלישת תאים.