فحص CAM-Delam لتسجيل الخصائص النقيلية عن طريق تحديد قدرة التحلل والغزو للخلايا السرطانية
Summary
إن اختبار CAM-Delam لتقييم القدرة النقيلية للخلايا السرطانية سريع نسبيا وسهل ورخيص. يمكن استخدام هذه الطريقة لكشف الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين ورم خبيث ولفحص الأدوية. يمكن أن يكون الفحص الأمثل لتحليل عينات الورم البشري طريقة سريرية لعلاج السرطان الشخصي.
Abstract
السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان هو تكوين ورم خبيث (أي عندما تنتشر الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى الأعضاء البعيدة وتشكل أوراما ثانوية). التفكيك ، الذي يعرف بأنه تدهور الصفيحة القاعدية والغشاء السفلي ، هو العملية الأولية التي تسهل انتقال الخلايا السرطانية وانتشارها إلى الأنسجة والأعضاء الأخرى. إن تسجيل قدرة الخلايا السرطانية على التفكيك يشير إلى الإمكانات النقيلية لهذه الخلايا.
لقد طورنا طريقة موحدة ، وهي فحص CAM-Delam السابق ، لتصور وتحديد قدرة الخلايا السرطانية على التطهير والغزو ، وبالتالي القدرة على تقييم العدوانية النقيلية. باختصار ، تتضمن طريقة CAM-Delam بذر الخلايا السرطانية في حلقات السيليكون على الغشاء المشيمي (CAM) في اليوم الجنيني 10 ، تليها الحضانة من ساعات إلى بضعة أيام. يتضمن فحص CAM-Delam استخدام غرفة رطبة داخلية أثناء حضانة جنين الفرخ. أدى هذا النهج الجديد إلى زيادة بقاء الجنين من 10٪ -50٪ إلى 80٪ -90٪ ، مما أدى إلى حل المشكلات التقنية السابقة مع انخفاض معدلات بقاء الجنين في اختبارات CAM المختلفة.
بعد ذلك ، تم عزل عينات CAM مع مجموعات الخلايا السرطانية المرتبطة بها وإصلاحها وتجميدها. وأخيرا، تم تصور العينات المجزأة بالتبريد وتحليلها بحثا عن تلف الغشاء السفلي وغزو الخلايا السرطانية باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية. من خلال تقييم مختلف خطوط الخلايا السرطانية النقيلية وغير النقيلية المعروفة المصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، أظهرت النتائج الكمية ل CAM-Delam أن أنماط قدرة التفكيك تعكس العدوانية النقيلية ويمكن تسجيلها في أربع فئات. الاستخدام المستقبلي لهذا الفحص ، بصرف النظر عن تحديد قدرة التفكيك كميا كمؤشر على العدوانية النقيلية ، هو الكشف عن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التفكيك ، والغزو ، وتشكيل النقائل الدقيقة ، والتغيرات في البيئة الدقيقة للورم.
Introduction
ما يقرب من 90 ٪ من الوفيات في مرضى السرطان ناتجة عن عواقب ورم خبيث للسرطان ، وهو تكوين أورام ثانوية في أجزاء أخرى من الجسم من حيث نشأ السرطان في الأصل1. لذلك ، من المهم تحديد الآليات المتعلقة بالنقائل للعثور على أهداف محتملة لقمع تكوين النقائل السرطانية. في وقت لاحق ، هناك حاجة إلى أنظمة نموذجية يمكن من خلالها تقييم العملية النقيلية.
أثناء الانبثاث ، تخضع الخلايا السرطانية للانتقال الظهاري إلى الوسيط (EMT) ، وهي عملية خلوية طبيعية تفقد فيها الخلايا الظهارية خصائص الالتصاق والقطبية وبدلا من ذلك تكتسب طابعا وسيطا غازيا2. التفكيك هو جزء من عملية EMT وينطوي على تدهور اللامينين في الغشاء السفلي ، وهو شرط أساسي للخلايا السرطانية لمغادرة الورم الأساسي وغزو الأنسجة الأخرى. تشمل العوامل الرئيسية التي يتم تنظيمها أثناء تكوين ورم خبيث مصفوفة ميتالوبروتيناز (MMPs) ، و ADAM (ثنائي intergin و metalloproteinase) ، و ADAMTS (ADAM مع زخارف ثرومبوسبوندين) ، و MMPs من نوع الغشاء (MT-MMPs) 3,4. هذه العوامل تتحلل جزيئات مثل اللامينين ، والتي يتم التعبير عنها في جميع الأغشية السفلية ، لتسهيل هجرة الخلايا والغزو.
الغشاء المشيمي (CAM) لبيضة الفرخ المخصبة هو نوع من الغشاء السفلي. تم استخدام بيض الفرخ المخصب كنماذج نقيلية ، حيث تم زرع الخلايا السرطانية على CAM خارج الجنين وتشكيل ورم خبيث لاحق لوحظ في أجنة الفرخ5. علاوة على ذلك ، كثيرا ما تستخدم النماذج النقيلية للفئران في الجسم الحي ، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية في الفئران ويتم تحليل النقائل في مختلف الأعضاء6. هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومكلفا وقد يسبب إزعاجا للحيوانات. لمعالجة هذا ، قمنا بتطوير فحص CAM-Delam ، وهو نموذج أسرع وأرخص لتقييم العدوانية النقيلية للخلايا السرطانية. في هذا النموذج ، يتم الجمع بين قدرة الخلايا السرطانية على تحلل CAM الفرخ (على سبيل المثال ، قدرة التفكيك) مع غزو الخلايا السرطانية المحتمل في اللحمة المتوسطة وتستخدم كمقياس للعدوانية النقيلية.
تصف هذه المقالة ، استنادا إلى منشور سابق7 ، فحص CAM-Delam بالتفصيل ، من التعامل مع بيض الفرخ المخصب ، وزراعة الخلايا السرطانية والبذر ، والتشريح ، وتحليل عينات CAM ، إلى تسجيل قدرة التفكيك للخلايا السرطانية إلى أربع فئات: سليمة ، معدلة ، تالفة ، وغزو. كما نعطي أمثلة على كيفية استخدام هذا الفحص لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم عملية التفكيك.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة فحص CAM-Delam لتقييم العدوانية النقيلية للخلايا السرطانية ، والتي يتم تحديدها من خلال تسجيل تعديلات الصفيحة القاعدية وغزو الخلايا المحتمل في اللحمة المتوسطة في غضون ساعات إلى بضعة أيام. كانت المشكلة التقنية السابقة لمختلف فحوصات الطب التكميلي والبديل هي انخفاض بقاء أجنة الكتاكيت. تم حل هذه المشكلة عن طريق إدخال استخدام غرفة ترطيب داخلية أثناء حضانة الجنين ، مما زاد من بقاء الجنين من 10٪ -50٪ إلى 80٪ -90٪ 7. لذلك ، قد يكون استخدام غرفة رطبة داخلية ذا قيمة في اختبارات CAM بشكل عام ، وكذلك في تجارب الفرخ السابقة الأخرى.
تستند نقاط وقت التسجيل المقدمة عند 14 ساعة و 1.5 يوم و 2.5 يوم و 3.5 أيام بعد بذر 1 × 106 خلايا سرطانية على CAM إلى تطوير طريقة صارمة باستخدام ستة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية وهي كافية لتمييز النطاق من قدرات خطوط الخلايا السرطانية غير المخففة إلى التصويب مع الغزو. يقترح استخدام أربع بيضات كحد أدنى مع ثلاث حلقات في كل نقطة زمنية ولكل خط خلية ، ويجب تكرار ذلك مرة واحدة على الأقل أو وفقا للتصاميم التجريبية والمتطلبات الإحصائية. تتمثل إحدى مزايا فحص CAM-Delam في الحصول على نتائج غنية بالمعلومات فيما يتعلق بقدرة الخلايا السرطانية على التفكيك في غضون أيام قليلة لتقدير عدوانية الخلايا السرطانية والمخاطر المحتملة لتشكيل ورم خبيث. يتم تسهيل التسليم السريع للنتائج من خلال مراقبة تدهور الصفيحة القاعدية بسبب الخلايا السرطانية الغازية والأورام الدقيقة اللاحقة / براعم الورم والنقائل العضوية. تقليديا ، تم استخدام نماذج CAM لتحليل تشكيل النقائل العضوية ، والتي تستغرق حوالي 2 أسابيع ليتم تحديدها9. باستخدام سبعة خطوط مختلفة للخلايا السرطانية ، قمنا سابقا بالتحقق من7 أن درجة التفكيك مرتبطة بقدرة الخلايا السرطانية على تكوين النقائل في نماذج القوارض10،11،12،13،14 ، والتي تدعم القيمة التنبؤية لفحص CAM-Delam. علاوة على ذلك ، تتطلب نماذج الفئران وقتا أطول ، من عدة أسابيع إلى أشهر ، قبل أن يمكن فحص النقائل15,16. باختصار ، فإن هذا الفحص المطور CAM-Delam ، الذي يركز على تسجيل قدرة التفكيك وليس على فحص تكوين الورم لاحقا في جنين الفرخ ، هو ، بالتالي ، مكمل جيد لغزو CAM الدجاج الحالي ونماذج ورم الفئران.
قد يكون أحد القيود في فحص CAM-Delam هو التصور غير الواضح للصفيحة القاعدية إذا كانت الخلايا السرطانية نفسها تعبر عن اللامينين. إذا كان الأمر كذلك ، يمكن استخدام علامات أخرى تشير إلى الصفيحة القاعدية ، مثل E-cadherin ،7. استخدمت دراسات غزو CAM الأخرى الكولاجين من النوع الرابع لتصور CAM و pan-cytokeratin و vimentin لتحديد الخلايا السرطانية الغازية وتشكيل الأورام الدقيقة / براعم الورم17,18.
التفكيك هو عملية خلوية طبيعية ، سواء أثناء التطور أو في وقت لاحق من الحياة ، مما يجعل من الممكن للخلايا مغادرة ظهارة والهجرة إلى أنسجة أخرى. أمثلة على الخلايا اللامعة أثناء التطور هي القمة العصبية والخلايا العصبية الرائدة الشمية19,20; في وقت لاحق من الحياة ، يعتمد التئام الجروح على التفكيك21. أثناء السرطان ، يتم تنظيم هذه العملية في الخلايا الخاطئة و / أو في الوقت الخطأ. وبالتالي ، يمكن أن تكون طريقة CAM-Delam مفيدة لكشف الآليات الجزيئية التي تنظم التفكيك ، والتي ستكون ذات أهمية لكل من المعرفة البيولوجية والمرضية الأساسية. وتشمل دراسات التفكيك هذه إضافة عوامل ذات أهمية للخلايا السرطانية المزروعة في الطب التكميلي والبديل أو دراسة الخلايا السرطانية المعدلة وراثيا. أحد الأمثلة المعروضة هنا هو المعالجة المسبقة ل CoCl2 لخط الخلايا غير النقيلي U251 للحث على نقص الأكسجة ، مما يؤدي إلى تحريض قدرة عدوانية نقلية يمكن قمعها بواسطة مثبط MMP واسع الطيف. وبالتالي ، فإن العثور على جزيئات رئيسية تتحكم في التفكيك يزيد من إمكانية تصميم مثبطات لقمع هذه العملية. فيما يتعلق بذلك ، هناك استخدام محتمل آخر لبروتوكول CAM-Delam في فحص الأدوية لقمع التفكيك وغزو الخلايا. علاوة على ذلك ، في العيادة ، يعد تقييم شدة السرطان عنصرا حاسما في التشخيص والتخطيط للعلاج والرعاية. حاليا ، نظام التدريج TNM (T ، حجم الورم; N ، العقدة – ما إذا كان السرطان قد انتشر إلى الغدد الليمفاوية ؛ M ، ورم خبيث بعيد) يستخدم لتقييم شدة السرطان22. يحدد فحص CAM-Delam نهجا مبتكرا لتقييم عدوانية الخلايا السرطانية والمخاطر المحتملة لتشكيل النقائل وقد يكون مكملا مفيدا لنظام التدريج TNM. ومن الجدير بالذكر أن تدريج TNM يعتمد على تحليلات عينات الأنسجة الثابتة ، في حين أن نهج CAM-Delam السريري المحتمل من شأنه أن يفحص الأنسجة الطازجة أو المجمدة الطازجة بالاقتران مع تقنيات إحياء الخلايا المجمدة23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الباحثين التاليين في جامعة أوميا على مساعدتهم في خطوط الخلايا السرطانية ذات الصلة والأجسام المضادة: L. Carlsson (الجسم المضاد لعامل فون ويلبراند) ، J. Gilthorpe (U251) ، و M. Landström (PC-3U). كما نشكر Hauke Holthusen في مختبر Gilthorpe على توليد خط الخلايا المستقرة HEK293-TLR-AAVS1. تم دعم العمل في مختبر Gunhaga من قبل مؤسسة السرطان السويدية (18 0463) ، وحاضنة Umeå Biotech ، و Norrlands Cancerforskningsfond ، ومجلس البحوث السويدي (2017-01430) ، وكلية الطب في جامعة أوميا.
Materials
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. Zebrafish von Willebrand factor. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
