Анализ CAM-Delam для оценки метастатических свойств путем количественной оценки расслоения и инвазионной способности раковых клеток

Вкратце, на рисунке 1 обобщены общие шаги в анализе CAM-Delam. Приведенный ниже протокол основан на 30 культивируемых оплодотворенных куриных яйцах и использовании двух различных линий раковых клеток, посеянных отдельно в трех кольцах / яйцеклетке и проанализированных в четырех временных точках. 1. Инкубация яиц Используйте оплодотворенные яйца цыплят из местного инкубатория, которые гарантируют более 90% оплодотворенияПРИМЕЧАНИЕ: Яйца не должны были храниться более 4 дней при комнатной температуре (RT). В Швеции этическое разрешение на экспериментальное использование эмбриональных цыплят требуется только с эмбрионального дня (E) 14 и далее. При необходимости тщательно механически протрите грязь или перья на яйцах с помощью сухого бумажного полотенца или смочите в воде. Очистите и стерилизуйте инкубатор яиц 70% этанолом перед использованием (каждый раз). Поместите нужное количество яиц в лотки для яиц и высиживайте яйца цыплят горизонтально в инкубаторе для яиц при температуре 37,5-38 °C при влажности 70%. Рассмотрим это как инкубационный день 0 (рисунок 1А). 2. Подготовка весовой лодки, пластиковых коробок и инструментов для рассечения Используйте 70% этанола для стерилизации 30 весовых лодок и 30 небольших пластиковых коробок (~ 0,4 л) с прозрачными колпачками. Высушите весовые лодки и ящики в ламинарной вытяжке на ночь (ON) и храните в закрытой пластиковой коробке до дальнейшего использования в 3-й день инкубации. Стерилизуют 2 л дистиллированного или деионизированного H2Oна 30 инкубированных яиц. Стерилизуйте две пары ножниц и три пары щипцов, распыляя 70% этанола. Высушите инструменты на воздухе, а затем храните их в стерилизованной коробке до 3-го дня инкубации.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти действия (Шаги 2.1-2.4) могут быть выполнены за любой день до 3-го дня инкубации. Используйте перчатки, чтобы избежать загрязнения. 3. Вскрытие яиц и перенос во внутреннюю увлажненную камеру ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения. Добавьте приблизительно 50 мл стерилизованногоH2Oв стерилизованные пластиковые коробки. Храните заполненные водой коробки с закрытыми крышками, чтобы избежать загрязнения, на RT до использования. На 3-й день инкубации разбейте яичную скорлупу острой частью ножниц и вырежьте прямое отверстие в скорлупе. Вручную разбейте яичную скорлупу над весовой лодкой и соберите яичный белок, желток и прикрепленный к нему здоровый эмбрион в весовую лодку (рисунок 1B). Ищите неповрежденный эмбрион с бьющимся сердцем, неповрежденным желтком и развитыми кровеносными сосудами для эксперимента (>95% инкубированных яиц). Выбросьте яйца с деформированным эмбрионом, эмбрионом без бьющегося сердца, разбитым яичным желтком или поврежденными кровеносными сосудами желтка. Аккуратно перенесите весовую лодку во внутреннюю увлажненную камеру.ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 3.2.-3.4 работайте как можно быстрее, чтобы избежать загрязнения, и, если возможно, используйте ламинарный капюшон. Инкубируют внутреннюю увлажненную камеру в инкубаторе яиц (рисунок 1С). Культивируйте яйца без скорлупы с 3-го по 10-й день в инкубаторе для яиц перед использованием (см. Шаг 3.6.), а при необходимости добавляйте воду в инкубатор для поддержания влажности 70%. Проверяйте внутренние увлажненные камеры через прозрачную пластиковую крышку на наличие мертвых эмбрионов или загрязненных яиц без скорлупы каждый день и извлекайте их из инкубатора. 4. Подготовка силиконовых колец Для приготовления силиконовых колец вырежьте силиконовую трубку с внутренним и наружным диаметром 4 мм и 5 мм соответственно толщиной ~1 мм, предпочтительно с помощью бумагореза (рисунок 1D). Переложите силиконовые кольца на небольшие стеклянные бутылки (рисунок 1D), накройте металлической фольгой и стерилизуйте их с помощью автоклава или аналогичного.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного автоклавирования неиспользуемых силиконовых колец, которые могут быть загрязнены, поскольку такая обработка снижает способность силиконовых колец прикрепляться к мембране с последующей утечкой раствора раковых клеток / коллагена / RPMI за пределы колец. Храните стерильные силиконовые кольца в RT.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен за любой день до 10-го дня инкубации. 5. Подготовка раковых клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Такие растворы, как клеточная культуральная среда, трипсин и 1x PBS, хранятся при 4 °C и должны быть нагреты до 37 °C на водяной бане перед добавлением в клетки. После нагрева промойте флаконы в 70% этаноле и высушите перед использованием. Культивируйте интересующие линии раковых клеток в соответствующей культуральной среде в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C в присутствии 5% (v/v) CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь клетки рака предстательной железы U251-GFP и PC-3U-GFP культивировали в полной среде RPMI medium-RPMI с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (PS). Спланируйте культуру раковых клеток таким образом, чтобы примерно 50 × 106 раковых клеток были готовы к сбору на 10-й день инкубации анализа CAM-Delam. Меняйте среду культивирования клеток каждые 2-3 дня или когда цвет среды меняется с розового на оранжевый/желтый. Необязательно: Индуцировать гипоксию путем лечения раковых клеток CoCl2 для исследования молекулярно-механистического воздействия на расслоение за 1 день до сбора клеток.ВНИМАНИЕ: CoCl2 обладает умеренной токсичностью. Осторожно обращайтесь с вытяжным кожухом и следуйте инструкциям производителя. Приготовить свежий 20 мМ CoCl2 стоковый раствор, растворив 0,0258 г в 10 мл стерилизованного дистиллированногоH20 в конической трубке объемом 15 мл, обернутой алюминиевой фольгой для защиты от света. В конической пробирке объемом 50 мл смешайте 250 мкл 20 мМ раствора CoCl2 в 25 мл среды RPMI, дополненной 1% (v/v) PS (но без FBS) на чашку для культивирования клеток диаметром 15 см. Вихрь осторожно. Удалите полную среду RPMI из посуды для клеточных культур. Промойте ячейки стерилизованным 1x PBS 2x. Добавьте 25 мл среды RPMI с трипсинизацией клетокCoCl2 200 мкМ (см. Шаг 5.6). На 10-й день инкубации яиц приготовьте 1 мл смеси коллаген/RPMI (соотношение 1:3), содержащей 250 мкл коллагена I типа (5 мг/мл) и 750 мкл клеточной культуры RPMI среды, дополненной 10% FBS и 1% (v/v) PS. Держите коллаген/RPMI-смесь на льду. Трипсинизировать раковые клетки, чтобы изолировать клетки, сначала удалив питательную среду клеток и промыв 2x с 1x PBS. Добавьте 3 мл раствора трипсина (0,05%) на чашку для культивирования клеток диаметром 15 см и инкубируйте в течение 2-3 мин в инкубаторе клеточной культуры до тех пор, пока клетки не отсоединятся. Используйте настольный инвертированный микроскоп, чтобы увидеть отсоединенные клетки. При необходимости осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы выбить оставшиеся сгруппированные или прикрепленные клетки. Инактивировать трипсин, добавляя 5 мл полной среды RPMI в каждую чашку для клеточной культуры и собирая клеточную суспензию из всех тарелок для клеточных культур в пробирку объемом 50 мл. Подсчитывайте раковые клетки методом исключения Trypan Blue, чтобы отличить живые клетки от мертвых, используя счетчик клеток. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 10 мкл 0,4% трипан синего пятна. Перемешайте образец путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, а затем загрузите 10 мкл клеточной смеси на камеру в слайд образца в счетчике ячеек. Повторите подсчет ячеек 3x, чтобы проверить номер ячейки/мл. Рассчитайте и центрифугируйте правильную объемную суспензию клеточной культуры, содержащую 50 х 106 живых раковых клеток в пробирке объемом 50 мл при 500 × г в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта и смешайте клеточную гранулу с 1 мл смеси коллаген/RPMI. Поскольку коллаген является желатиновым материалом, смешайте клетки очень медленно и осторожно с пипеткой 1 мл, чтобы избежать потери клеток при образовании пузырьков. Держите подготовленную клеточную суспензию на льду и поднесите ее в рабочую зону яйца.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком долгого хранения подготовленных раковых клеток на льду. Подготовленные раковые клетки необходимо поместить на КАМ в течение 15-25 мин. 6. Посев раковых клеток на CAM ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения. На 10-й день инкубации выньте из инкубатора внутренние увлажненные камеры с инкубированными яйцами без скорлупы.ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 90% от первоначального числа инкубированных яиц может быть использовано; см. рисунок 2. Откройте внутреннюю увлажненную камеру и поместите до шести силиконовых колец на CAM с помощью стерилизованных щипцов.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения силиконовых колец рядом друг с другом или близко к более крупным кровеносным сосудам. Смешайте суспензию раковых клеток путем пипетирования, чтобы получить равномерное распределение раковых клеток, и добавьте 20 мкл (1 × 106 клеток) подготовленной суспензии раковых клеток внутри силиконового кольца (рисунок 1E). При добавлении ячеек держите наконечник пипетки над CAM, чтобы убедиться, что вы не повредили мембрану.ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущим выводам7, различные раковые клетки могут быть посеяны в отдельные кольца на одном и том же CAM. Закройте внутреннюю увлажненную камеру и поместите ее в инкубатор для яиц. 7. Выделение CAM с ассоциированными раковыми клетками Через 14 ч, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня инкубации вынимают примерно семь внутренних увлажненных камер и открывают крышки по одной. С помощью ножниц рассекните культивируемые раковые клетки, прикрепленные к CAM (так называемые образцы CAM-Delam), разрезав за пределы силиконового кольца (рисунок 1F). Немедленно перенесите изолированный образец CAM-Delam с помощью щипцов на 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ) в чашку Петри для фиксации ткани. Хранить на льду или при температуре 4 °C в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить 4% раствор PFA при 4 °C в течение максимум 5 дней. ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. При работе с порошком PFA и растворами PFA используйте вытяжной капюшон и носите маску для лица и перчатки. Избегайте вдыхания порошка или паров раствора. Следуйте инструкциям производителя. Обезглавить куриные эмбрионы и выбросить как биологические отходы в определенные контейнеры. Удалите 4% раствор PFA и добавьте 30% сахарозы в 0,1 М ПБ в образцы CAM-Delam и уравновесьте при 4 °C в течение 1 ч. Под рассеченным микроскопом аккуратно снимите силиконовое кольцо с помощью щипцов. Ножницами вырежьте образец CAM-Delam в прямоугольной форме с раковыми клетками посередине (рисунок 1G). С помощью пары щипцов перенесите образцы CAM-Delam в замороженную среду в чашке Петри, чтобы удалить избыток сахарозы, а затем вставить формы в замороженную среду. Под рассеченным микроскопом расположите образец CAM-Delam в U-образной форме в вертикальном направлении во встраиваемых формах с помощью любого игольчатого инструмента (рисунок 1G). Заморозьте и храните образцы CAM-Delam при температуре −80 °C. 8. Секционирование образцов CAM-Delam Секционирование замороженных образцов CAM-Delam на 10 мкм на 5-6 последовательных слайдах с помощью криосекции. Храните слайды с разрезами при температуре −80 °C или используйте непосредственно для иммуногистохимического окрашивания. 9. Иммуногистохимическое окрашивание Доведите слайды от −80 °C до RT в течение 5 мин перед началом иммунопротокола. Сделайте линию гидрофобным маркером на слайдах, где заканчиваются участки. Дайте им высохнуть в течение нескольких минут. Поместите слайды в увлажненную (H2O) камеру и накройте участки ~200-500 мкл блокирующего раствора (10% сыворотки для телят плода и 0,1% азида натрия в трис-буферном физиологическом растворе с 0,1% Triton X-100 [TBST]) и инкубируйте в течение 15-30 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, не позволяйте слайдам высохнуть в любое время. Слейте блокирующий раствор и замените его 100-150 мкл интересующего первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, и инкубируют ON при 4 °C. Предпочтительно использовать антитело против ламинина-111 кролика для определения базальной пластинки вместе с маркером раковых клеток, если не используют GFP или другие флуоресцентно-помеченные линии раковых клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь кролик анти-фон Виллебранд Фактор также использовался для обнаружения кровеносных сосудов в CAM. Приготовьте три стеклянные кюветы, наполненные буфером TBST. Вылейте раствор первичного антитела, перенесите слайды в стеклянные кюветы и промыть не менее 3x в течение 5 мин каждый в TBST. Удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области с помощью мягкой бумажной салфетки. Накройте слайд 100-150 мкл подходящего вторичного флуоресцентного антитела, разведенного в блокирующем растворе в сочетании с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом, дигидрохлоридом (DAPI) и инкубатом в темноте при RT в течение 1 ч. Вылейте раствор вторичных антител, перенесите слайды в стеклянные кюветы и промыть не менее 3x в течение 5 минут каждый в TBST. Удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области с помощью мягкой бумажной салфетки. Установите слайды, положив 1-2 капли флуоресцентной монтажной среды на слайд, и аккуратно поместите стеклянную крышку, избегая пузырьков воздуха. Дайте слайдам высохнуть в течение не менее 1 ч при 4 °C перед анализом и храните слайды при температуре 4 °C. 10. Микроскопическая визуализация и оценка расслоения Сфотографируйте участки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, предпочтительно с 10-кратным увеличением (рисунок 1H). Проанализируйте разделы, используя следующие категории оценки CAM-Delam (рисунок 3): Ищите неповрежденную базальную пластинку без видимых изменений. Ищите измененную, но неповрежденную базальную пластинку. Ищите поврежденную базальную пластинку без клеточной инвазии. Ищите поврежденную базальную пластинку с клеточной инвазией.