Test CAM-Delam pour évaluer les propriétés métastatiques en quantifiant la capacité de délamination et d’invasion des cellules cancéreuses

En bref, la figure 1 résume les étapes globales du test CAM-Delam. Le protocole ci-dessous est basé sur 30 œufs de poule fécondés en culture et l’utilisation de deux lignées cellulaires cancéreuses différentes ensemencées séparément en trois anneaux / œuf et analysées à quatre moments. 1. Incubation d’œufs Utilisez des œufs de poussins fécondés provenant d’un couvoir local, qui garantissent une fécondation de plus de 90%REMARQUE: Les œufs ne doivent pas avoir été conservés pendant plus de 4 jours à température ambiante (RT). En Suède, l’autorisation éthique pour l’utilisation expérimentale de poulets embryonnaires n’est requise qu’à partir du jour embryonnaire (E) 14 et au-delà. Si nécessaire, essuyez soigneusement mécaniquement toute saleté ou plume sur les œufs à l’aide d’une serviette en papier sec ou humide dans l’eau. Nettoyez et stérilisez l’incubateur à œufs avec 70% d’éthanol avant utilisation (à chaque fois). Placez le nombre d’œufs souhaité dans des plateaux à œufs et incubez les œufs de poussin horizontalement dans un incubateur à œufs à 37,5-38 ° C avec 70% d’humidité. Considérez-le comme le jour d’incubation 0 (Figure 1A). 2. Préparation du bateau de pesage, des boîtes en plastique et des instruments de dissection Utilisez 70% d’éthanol pour stériliser 30 bateaux de pesage et 30 petites boîtes en plastique (~ 0,4 L) avec des bouchons transparents. Sécher les bateaux et les boîtes de pesage dans une hotte laminaire pendant la nuit (ON) et les conserver dans une boîte en plastique fermée jusqu’à ce qu’ils soient utilisés le jour 3 de l’incubation. Stériliser 2 L deH2O distillé ou désionisé pour 30 œufs incubés. Stériliser deux paires de ciseaux et trois paires de pinces en pulvérisant 70% d’éthanol. Séchez les instruments à l’air libre, puis conservez-les dans une boîte stérilisée jusqu’au jour d’incubation 3.REMARQUE: Ces actions (étapes 2.1 à 2.4) peuvent être effectuées n’importe quel jour avant le jour d’incubation 3. Utilisez des gants pour éviter la contamination. 3. Ouverture des œufs et transfert dans la chambre humidifiée interne REMARQUE: Utilisez des gants et un masque facial pour éviter la contamination. Ajouter environ 50 mL de H2O stérilisé aux boîtes en plastique stérilisées. Gardez les boîtes remplies d’eau avec des couvercles fermés, pour éviter toute contamination, à RT jusqu’à utilisation. Le jour d’incubation 3, craquez la coquille d’œuf à l’aide de la partie tranchante des ciseaux et coupez une ouverture droite dans la coquille. Ouvrez manuellement la coquille d’œuf au-dessus d’un bateau de pesée et collectez le blanc d’œuf, le jaune et l’embryon sain qui y est attaché dans le bateau de pesage (Figure 1B). Recherchez un embryon intact avec un cœur battant, un jaune intact et des vaisseaux sanguins développés pour l’expérience (>95% des œufs incubés). Jetez les œufs avec un embryon malformé, un embryon sans cœur battant, un jaune d’œuf cassé ou des vaisseaux sanguins jaunes endommagés. Transférez doucement le bateau de pesage dans une chambre interne humidifiée.REMARQUE: Pour les étapes 3.2.-3.4., travaillez le plus rapidement possible pour éviter la contamination et, si possible, utilisez une hotte laminaire. Incuber la chambre humidifiée interne dans l’incubateur à œufs (Figure 1C). Cultivez les œufs sans coquille du jour 3 au jour 10 dans l’incubateur à œufs avant de les utiliser (voir l’étape 3.6.), et au besoin, ajoutez de l’eau à l’incubateur pour maintenir 70% d’humidité. Vérifiez tous les jours les chambres internes humidifiées à travers le couvercle en plastique transparent les embryons morts ou les œufs contaminés sans coquille et retirez-les de l’incubateur. 4. Préparation des anneaux en silicone Pour préparer des bagues en silicone, coupez un tube en silicone d’un diamètre intérieur et extérieur de 4 mm et 5 mm, respectivement, en ~1 mm d’épaisseur, de préférence à l’aide d’un coupe-papier (Figure 1D). Transférer les anneaux de silicone dans de petites bouteilles en verre (Figure 1D), les recouvrir d’une feuille de métal et les stériliser à l’aide d’un autoclave ou similaire.REMARQUE: Évitez l’autoclavage répété des anneaux de silicone inutilisés qui pourraient être contaminés, car un tel traitement diminue la capacité des anneaux de silicone à se fixer à la membrane, avec fuite ultérieure de la solution de cellule cancéreuse / collagène / RPMI à l’extérieur des anneaux. Conservez les anneaux en silicone stériles à RT.REMARQUE: Cette étape peut être effectuée n’importe quel jour avant le jour d’incubation 10. 5. Préparation des cellules cancéreuses REMARQUE: Les solutions telles que le milieu de culture cellulaire, la trypsine et 1x PBS sont stockées à 4 ° C et doivent être chauffées à 37 ° C dans un bain-marie avant d’être ajoutées aux cellules. Après chauffage, rincer les bouteilles dans de l’éthanol à 70% et sécher avant utilisation. Cultiver les lignées cellulaires cancéreuses d’intérêt dans le milieu de culture concerné dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C en présence de 5 % (v/v) de CO2.REMARQUE: Ici, le glioblastome U251-GFP et les cellules cancéreuses de la prostate PC-3U-GFP ont été cultivés dans un milieu RPMI moyen-RPMI complet complété par 10% (v / v) sérum fœtal bovin (FBS) et 1% (v / v) pénicilline-streptomycine (PS). Planifiez la culture de cellules cancéreuses de sorte qu’environ 50 × 106 cellules cancéreuses soient prêtes à être récoltées le jour 10 de l’incubation du test CAM-Delam. Changez le milieu de culture cellulaire tous les 2-3 jours, ou lorsque la couleur moyenne passe du rose à l’orange/jaune. Facultatif: Induire l’hypoxie en traitant les cellules cancéreuses avec CoCl2 pour étudier les effets mécanistes moléculaires sur la délamination 1 jour avant le prélèvement cellulaire.ATTENTION : La CoCl2 a une toxicité modérée. Manipulez avec soin dans une hotte et suivez les instructions du fabricant. Préparer une solution mère fraîche de CoCl2 de 20 mM en dissolvant 0,0258 g dans 10 mL deH20 distillé stérilisé dans un tube conique de 15 mL enveloppé de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Dans un tube conique de 50 mL, mélanger 250 μL de la solution mère de CoCl2 de 20 mM dans 25 mL de milieu RPMI complété par 1 % (v/v) de PS (mais sans FBS) par boîte de culture cellulaire de 15 cm de diamètre. Vortex doucement. Retirez le milieu RPMI complet des boîtes de culture cellulaire. Lavez les cellules avec 1x PBS 2x stérilisé. Ajouter 25 mL de milieu RPMI avec une trypsinisation à 2 cellules CoCl2 de μM (voir l’étape 5.6). Le jour 10 de l’incubation des œufs, préparer 1 mL d’un mélange collagène/RPMI (rapport 1:3), contenant 250 μL de collagène de type I (5 mg/mL) et 750 μL de milieu RPMI de culture cellulaire complété par 10 % de FBS et 1 % (v/v) PS. Conservez le mélange collagène/RPMI sur glace. Trypsiniser les cellules cancéreuses pour isoler les cellules en retirant d’abord le milieu de culture cellulaire et laver 2x avec 1x PBS. Ajouter 3 mL de solution de trypsine (0,05%) par boîte de culture cellulaire de 15 cm de diamètre et incuber pendant 2-3 min dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent. Utilisez un microscope inversé sur table pour voir les cellules détachées. Si nécessaire, tapotez doucement le côté de la fiole pour déloger les cellules restantes regroupées ou attachées. Inactiver la trypsine en ajoutant 5 mL de milieu RPMI complet à chaque boîte de culture cellulaire et recueillir la suspension cellulaire de toutes les boîtes de culture cellulaire dans un tube de 50 mL. Compter les cellules cancéreuses par la méthode d’exclusion Trypan Blue pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes à l’aide d’un compteur de cellules. Ajouter 10 μL de la suspension cellulaire à 10 μL de tache bleu trypan à 0,4 %. Mélangez l’échantillon en pipetant de haut en bas plusieurs fois, puis chargez 10 μL du mélange cellulaire par chambre dans la lame d’échantillon dans le compteur de cellules. Répétez le comptage des cellules 3x pour vérifier le nombre de cellules/mL. Calculer et centrifuger la suspension de culture cellulaire volumique correcte contenant 50 x 106 cellules cancéreuses vivantes dans un tube de 50 mL à 500 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et mélanger la pastille cellulaire avec 1 mL du mélange collagène/RPMI. Comme le collagène est un matériau gélatineux, mélangez les cellules très lentement et soigneusement avec une pipette de 1 mL pour éviter de perdre des cellules dans la formation de bulles. Gardez la suspension cellulaire préparée sur de la glace et apportez-la à la zone de travail des œufs.REMARQUE: Évitez de garder les cellules cancéreuses préparées sur la glace trop longtemps. Les cellules cancéreuses préparées doivent être placées sur le CAM dans les 15 à 25 minutes. 6. Ensemencement des cellules cancéreuses sur le CAM REMARQUE: Utilisez des gants et un masque facial pour éviter la contamination. Au jour d’incubation 10, sortez les chambres humidifiées internes avec les œufs incubés sans coquille de l’incubateur.REMARQUE: Environ 90% du nombre initial d’œufs incubés peuvent être utilisés; voir la figure 2. Ouvrez la chambre humidifiée interne et placez jusqu’à six anneaux en silicone sur le CAM à l’aide de pinces stérilisées.REMARQUE: Évitez de placer les anneaux de silicone près les uns des autres ou près de plus gros vaisseaux sanguins. Mélanger la suspension de cellules cancéreuses par pipetage pour obtenir une distribution uniforme des cellules cancéreuses et ajouter 20 μL (1 × 106 cellules) de la suspension de cellules cancéreuses préparée à l’intérieur d’un anneau de silicone (Figure 1E). Lors de l’ajout des cellules, gardez l’embout de la pipette au-dessus du CAM pour vous assurer de ne pas endommager la membrane.REMARQUE: Selon les résultats précédents7, différentes cellules cancéreuses peuvent être ensemencées dans des anneaux séparés sur le même CAM. Fermez la chambre interne humidifiée et mettez-la dans l’incubateur à œufs. 7. Isolement du CAM avec les cellules cancéreuses associées Après 14 h, 1,5 jour, 2,5 jours et 3,5 jours d’incubation, sortez environ sept chambres internes humidifiées et ouvrez les couvercles un à la fois. À l’aide d’une paire de ciseaux, disséquez les cellules cancéreuses cultivées attachées au CAM (échantillons CAM-Delam) en coupant à l’extérieur de l’anneau de silicone (Figure 1F). Transférer immédiatement l’échantillon isolé de CAM-Delam à l’aide de pinces à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate (PB) de 0,1 M dans une boîte de Pétri pour la fixation du tissu. Conserver sur la glace ou à 4 °C pendant 1 h.REMARQUE: Conserver la solution de PFA à 4% à 4 °C pendant un maximum de 5 jours. ATTENTION : Le PFA est toxique. Lorsque vous manipulez de la poudre de PFA et des solutions de PFA, utilisez une hotte et portez un masque facial et des gants. Évitez d’inhaler de la poudre ou des vapeurs de solution. Suivez les instructions du fabricant. Décapiter les embryons de poulet et les jeter comme déchets biologiques dans des bacs spécifiques. Retirer la solution de PFA à 4 % et ajouter 30 % de saccharose dans 0,1 M PB aux échantillons CAM-Delam et équilibrer à 4 °C pendant 1 h. Sous un microscope à dissection, retirez soigneusement l’anneau en silicone à l’aide d’une pince. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez l’échantillon CAM-Delam de forme rectangulaire avec les cellules cancéreuses au milieu (Figure 1G). À l’aide d’une pince, transférer les échantillons CAM-Delam dans un milieu de section congelé dans une boîte de Pétri pour éliminer l’excès de saccharose, puis pour incorporer des moules dans un milieu de section congelé. Sous un microscope à dissection, positionnez l’échantillon CAM-Delam en forme de U dans une direction verticale dans les moules d’encastrement à l’aide de n’importe quel instrument en forme d’aiguille (Figure 1G). Congeler et conserver les échantillons CAM-Delam à −80 °C. 8. Sectionnement des échantillons CAM-Delam Découper les échantillons CAM-Delam congelés à 10 μm sur 5 à 6 lames consécutives en utilisant la cryosection. Conservez les lames avec des sections à −80 °C ou utilisez-les directement pour la coloration immunohistochimique. 9. Coloration immunohistochimique Porter les lames de −80 °C à RT pendant 5 min avant de commencer l’immunoprotocole. Faites une ligne avec un marqueur hydrophobe sur les diapositives où les sections se terminent. Laissez-les sécher pendant quelques minutes. Placez les lames dans une chambre humidifiée (H2O) et couvrez les sections avec ~200-500 μL de solution bloquante (10% de sérum de veau fœtal et 0,1% d’azoture de sodium dans une solution saline tamponnée Tris avec 0,1% de Triton X-100 [TBST]) et incubérez pendant 15-30 min.REMARQUE: À partir de cette étape, ne laissez pas les lames sécher à tout moment. Verser la solution bloquante et la remplacer par 100-150 μL de l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans la solution bloquante et incuber ON à 4 °C. Utilisez de préférence un anticorps anti-laminine-111 de lapin pour définir la lame basale avec un marqueur de cellules cancéreuses, si vous n’utilisez pas de GFP ou d’autres lignées cellulaires cancéreuses marquées par fluorescence.REMARQUE: Ici, un facteur anti-von Willebrand de lapin a également été utilisé pour détecter les vaisseaux sanguins dans le CAM. Préparez trois cuvettes en verre remplies de tampon TBST. Versez la solution d’anticorps primaire, transférez les lames dans les cuvettes en verre et lavez au moins 3 fois pendant 5 minutes chacune dans tbST. Retirez l’excès de TBST de la glissière et de la zone de barrière hydrophobe avec un mouchoir en papier souple. Couvrir la lame avec 100-150 μL d’un anticorps fluorescent secondaire approprié dilué dans une solution bloquante combinée avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole, du dichlorhydrate (DAPI) et incuber dans l’obscurité à RT pendant 1 h. Versez la solution d’anticorps secondaire, transférez les lames dans les cuvettes en verre et lavez au moins 3 fois pendant 5 minutes chacune dans tbST. Retirez l’excès de TBST de la glissière et de la zone de barrière hydrophobe avec un mouchoir en papier souple. Montez les glissières en mettant 1 à 2 gouttes de support de montage fluorescent sur la glissière et placez doucement un couvercle en verre, en évitant les bulles d’air. Laissez sécher les lames pendant au moins 1 h à 4 °C avant l’analyse et conservez les lames à 4 °C. 10. Imagerie microscopique et notation de délamination Photographiez les sections à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photo numérique, de préférence à un grossissement de 10x (Figure 1H). Analysez les sections à l’aide des catégories de notation CAM-Delam suivantes (Figure 3) : Recherchez une lame basale intacte sans altérations visibles. Recherchez une lame basale altérée mais non endommagée. Recherchez une lame basale endommagée sans invasion cellulaire. Recherchez la lame basale endommagée avec invasion cellulaire.