Perfusão Normotérmica Ex Vivo do Pâncreas para Preservação de Aloenxertos de Pâncreas antes do Transplante

Todos os animais utilizados para este estudo receberam cuidados humanizados de acordo com os ”Principles of Laboratory Animal Care” formulados pela National Society for Medical Research e o ”Guide for the Care of Laboratory Animals” publicado pelo National Institutes of Health, Ontário, Canadá. Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do Toronto General Research Institute. NOTA: Este protocolo de estudo é baseado em um modelo suíno. O enxerto é armazenado no frio por 2 h e, em seguida, é submetido à perfusão em máquina normotérmica por 3 h antes do transplante (Figura 1). 1. Animais Use porcos Yorkshire machos (40-50 kg). 2. Captação de órgãos OBS: O procedimento pré-operatório e parte do procedimento cirúrgico são os mesmos dos trabalhos anteriores publicados pelo nosso grupo15 e são os seguintes: Alojar os porcos na instalação de pesquisa por um período mínimo de 7 dias para permitir a aclimatação e reduzir seu nível de estresse. Jejuar os porcos por um mínimo de 6 h antes da indução anestésica. Sedar o porco com uma injeção intramuscular (IM) de midazolam (0,15 mg/kg), cetamina (25 mg/kg) e atropina (0,04 mg/kg).NOTA: Isso é feito no alojamento de instalação. Transfira o animal do alojamento para o centro cirúrgico (CC), onde será realizada a recuperação do órgão. Posicione o porco em decúbito dorsal sobre a mesa de SO e coloque uma máscara facial com 2 L de oxigênio e 5% de isoflurano até que a mandíbula esteja relaxada. Visualize as pregas vocais usando laringoscópio e pulverize-as com lidocaína a 2% para evitar espasmo durante a intubação. Substitua a máscara por oxigênio e isoflurano por pelo menos 30 s antes de tentar a intubação. Introduzir um tubo endotraqueal de 7 mm e bloquear o balonete com 5 mL de ar. Use capnometria para garantir que o tubo está na posição correta. Diminuir o gás isoflurano para 2,5%. Ligue o ventilador e regule-o para 15-20 ciclos/min e o volume corrente para 10-15 mL/kg de peso corporal. Monitore a frequência cardíaca e a saturação de oxigênio constantemente. Utilizando a técnica de Seldinger16, introduzir um cateter de 8,5 Fr. x 10 cm na veia jugular (direita ou esquerda). Utilizar o cateter da veia jugular para iniciar infusão de fentanil (2,5 mL em 500 mL de Ringer) a 250 mL/h. Verifique os reflexos musculares para determinar a profundidade da anestesia. O tônus mandibular é o reflexo muscular mais confiável 17.NOTA: Se a rigidez dos músculos mandibulares for observada, aumente a infusão de isoflurano e/ou fentanil. 3. Procedimento cirúrgico Desinfetar e cobrir o campo cirúrgico. Realizar uma incisão mediana desde a xifoide até a sínfise púbica. Estender o campo cirúrgico com incisão lateral esquerda para melhor exposição. Dissecar a veia cava inferior (VCI) da aorta abdominal. Libere ainda mais a aorta do tecido circundante e ligue os pequenos ramos da aorta lombar. Identificar e colocar ligaduras ao redor de ambas as artérias renais.NOTA: As ligaduras não devem ser amarradas neste momento. Uma vez que a parte de trás da aorta está livre, passe duas ligaduras ao seu redor. A ligadura inferior será eventualmente amarrada logo acima da bifurcação da artéria ilíaca e a ligadura superior será amarrada 5 cm acima da gravata anterior. Dissecar o hilo hepático. Amarre todas as artérias o mais próximo possível do fígado. Identifique o ducto biliar comum, coloque duas ligaduras próximas ao fígado e divida a estrutura. Dissecção em torno da aorta, mas não corte neste momento. Identificar e dissecar ao redor da porção supra-hepática da aorta e colocar uma gravata ao redor dela.NOTA: As ligaduras não devem ser amarradas neste momento. Abra o saco menor para permitir que o gelo resfrie o pâncreas. Mobilize o pâncreas o mínimo possível antes da descarga. Administrar 500 UI de heparina por kg de peso do doador através da linha central. Aguarde 5 min e inicie a coleta de sangue em bolsas de citrato, fosfato, dextrose, soro fisiológico, adenina, glicose e manitol (CPD/SAG-M) utilizando cateter jugular. Amarrar a ligadura aórtica inferior, canular a aorta com uma linha de nivelamento acima da ligação da bifurcação ilíaca e fixar a cânula com uma amarração superior. Ligate ambas as artérias renais. Amarrar a aorta supra-hepática (pinça cruzada) uma vez que sangue suficiente tenha sido coletado (600 mL). Administrar 10 mL de cloreto de potássio para sacrifício. Inicie uma lavagem com a solução de preservação da Universidade de Wisconsin (UW). Corte uma abertura na veia porta (o mais alto possível) e cava para ventilação. Coloque gelo na cavidade abdominal. Avaliar a cauda do pâncreas e a alça C do duodeno após lavar 1 L de solução de UW. Se houver lavagem adequada, iniciar a dissecção, identificar e pinçar os vasos mesentéricos. Diminua a velocidade de lavagem para o segundo litro de UW. Recuperar o enxerto pancreático e um segmento de cava ou veia ilíaca para extensão da veia porta.NOTA: O enxerto pancreático é removido com o baço. Coloque o órgão dentro de uma bolsa de órgãos que é colocada dentro de uma bacia cheia de gelo. 4. Preparo do enxerto pancreático em mesa traseira (Figura 2A) Remova a linha de nivelamento da parte distal da aorta e feche com uma gravata. Encha o saco do órgão com a solução UW restante. Liberte o pâncreas do tecido aderente, incluindo o baço. Realizar extensão da veia porta utilizando cava ou veia ilíaca previamente recuperada com Prolene 6-0. Canular a veia porta e a aorta proximal com redutor de 1/4 pol x 3/8. Canular a parte distal do duodeno com cateter Malecot e gravata. Aperte a extremidade do cateter para evitar o derramamento de conteúdo duodenal. Supervisionou os vasos mesentéricos com 4-0 Prolene. Registre o peso do enxerto. Manter o enxerto em câmara frigorífica estática (SCS) até o início da PPNEV. 5. Perfusão normotérmica ex vivo do pâncreas (PPNEV) OBS: O circuito de perfusão é composto por equipamento de circulação extracorpórea neonatal (Figura 3). Fixar a tubulação correspondente ao oxigenador e ao reservatório venoso, bem como a linha arterial à saída do oxigenador e colocar o filtro de bolhas em seu suporte. Conecte a linha de purga que vai do filtro de bolhas ao reservatório venoso. Abra a tampa do filtro de bolhas para deixar todo o ar sair. Conecte a linha venosa à entrada do reservatório venoso. Conecte o filtro de diálise e a tubulação onde o dialisato será infundido. Conecte o sensor do medidor de vazão, as linhas de pressão e a sonda de temperatura. Conecte as linhas de amostra arterial e venosa aos orifícios de amostragem. Colocar a câmara pancreática (Figura 3) sobre uma mesa Mayo e introduzir a tubulação arterial e venosa através dos orifícios destinados a este fim. Conecte e ligue o aquecedor externo. Coloque a tubulação de sucção dentro da bomba de roletes e conecte uma extremidade na tubulação que sai da câmara para coletar os fluidos, e a outra extremidade ao reservatório venoso para coletar todas as perdas de perfusato do órgão. Conecte a tubulação de oxigênio (verde) ao tanque de gás contendo a mistura de carbogênio (95% O 2/5% CO2) e ao oxigenador. Conecte a tubulação da unidade da bomba de aquecimento ao oxigenador. Apertar as linhas de saída arterial e venosa, bem como a saída do reservatório venoso. 6. Preparação do perfusato e priming do circuito Preencher o reservatório venoso com o perfusato (Tabela 1). Use uma bomba de seringa para administração contínua do vasodilatador (epoprostenol) a 8 mL/h na linha arterial. Utilizar uma segunda bomba de seringa para administração contínua do inibidor enzimático diretamente no reservatório venoso (15 mg, 10 mL/h). Ligue a máquina de pulmão cardíaco (HLM) e ligue os painéis de pressão, temperatura e temporizador. Ligue a bomba de aquecimento para aquecer a solução de perfusão a 38 °C. Abra a fonte O 2/CO2. Remova a pinça de tubulação colocada na saída do reservatório venoso, ligue a bomba centrífuga e leve-a até 1.500 rpm. Aperte a tubulação, contornando o filtro arterial e libere ar do filtro arterial. Zerar as linhas de pressão arterial e venosa. 7. Perfusão do enxerto de pâncreas (Figura 2B) Abra a bolsa de órgãos onde o pâncreas está armazenado. Lavar com 200 mL de albumina através da cânula arterial. Retire o pâncreas do gelo e posicione dentro da câmara do órgão. Confirme se a tubulação arterial e venosa estão livres de ar. Solte a pinça do lado arterial e pince o atalho entre a tubulação arterial e venosa. Uma vez que o sangue começa a sair da tubulação arterial, conecte a linha à cânula arterial. Ajuste a pressão arterial para 20-25 mmHg, regulando a velocidade da bomba centrífuga. Conecte a tubulação venosa assim que o sangue começar a sair da cânula venosa. Administrar um frasco de verapamil (2,5 mg/mL) diretamente no lado arterial, quando o pâncreas estiver completamente conectado e não houver sangramentos maiores. Registrar as pressões, o fluxo arterial, a temperatura e a secreção duodénica continuamente. Coletar sangue, registrar o débito duodenal a cada hora e avaliar macroscopicamente de hora em hora para edema. Registrar os parâmetros de perfusão e colher amostras para análise (gasometria venosa e arterial, bem como amostras de amilase, lipase e LDH). Desconecte a tubulação arterial e venosa quando a perfusão terminar, remova o enxerto da câmara do órgão e lave com UW fria e pese. Armazenar o enxerto no gelo em uma bolsa de órgão estéril até o momento do transplante.