Нормотермическая перфузия поджелудочной железы ex vivo для сохранения аллотрансплантатов поджелудочной железы перед трансплантацией

Все животные, использованные для этого исследования, получали гуманный уход в соответствии с «Принципами ухода за лабораторными животными», сформулированными Национальным обществом медицинских исследований, и «Руководством по уходу за лабораторными животными», опубликованным Национальными институтами здравоохранения, Онтарио, Канада. Все исследования были одобрены Комитетом по уходу за животными Общего научно-исследовательского института Торонто. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол исследования основан на модели свиней. Трансплантат хранится в холоде в течение 2 ч, а затем подвергается нормотермической машинной перфузии в течение 3 ч до трансплантации (рис. 1). 1. Животные Используют самцов йоркширских свиней (40-50 кг). 2. Закупка органов ПРИМЕЧАНИЕ: Предоперационная процедура и часть хирургической процедуры такие же, как и в предыдущих статьях, опубликованных нашей группой15 , и заключаются в следующем: Размещайте свиней в исследовательском центре не менее 7 дней, чтобы обеспечить акклиматизацию и снизить уровень стресса. Голодайте свиньям не менее 6 часов до введения анестезии. Успокоите свинью внутримышечной (IM) инъекцией мидазолама (0,15 мг/кг), кетамина (25 мг/кг) и атропина (0,04 мг/кг).ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается в жилом комплексе. Переведите животное из помещения содержания в операционную (операционную), где будет выполнено извлечение органа. Положите свинью в положение лежа на спине на операционном столе и наденьте маску для лица с 2 л кислорода и 5% изофлурана, пока челюсть не расслабится. Визуализируйте голосовые связки с помощью ларингоскопа и опрыскайте их 2% лидокаином, чтобы предотвратить спазм во время интубации. Замените маску кислородом и изофлураном не менее чем на 30 секунд перед попыткой интубации. Введите эндотрахеальную трубку диаметром 7 мм и заблокируйте манжету 5 мл воздуха. Используйте капнометрию, чтобы убедиться, что трубка находится в правильном положении. Уменьшите содержание газа изофлурана до 2,5%. Включите аппарат искусственной вентиляции легких и установите его на 15-20 вдохов в минуту и дыхательный объем на 10-15 мл / кг массы тела. Постоянно контролируйте частоту сердечных сокращений и насыщение кислородом. Используя технику Сельдингера 16, введите катетер размером 8,5 Fr. x10 см в яремную вену (правую или левую). Используйте катетер яремной вены, чтобы начать инфузию фентанила (2,5 мл в 500 мл Рингера) со скоростью 250 мл / час. Проверьте мышечные рефлексы, чтобы определить глубину анестезии. Тонус челюсти является самым надежным мышечным рефлексом 17.ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечается ригидность нижнечелюстных мышц, увеличьте инфузию изофлурана и/или фентанила. 3. Хирургическое вмешательство Продезинфицируйте и накройте операционное поле. Выполните разрез по средней линии от ксифоидной кости до лобкового симфиза. Расширьте операционное поле левым боковым разрезом для лучшего воздействия. Рассекают нижнюю полую вену (НПВ) от брюшной аорты. Далее освобождают аорту от окружающих тканей и перевязывают мелкие поясничные ветви аорты. Определите и поместите лигатуры вокруг обеих почечных артерий.ПРИМЕЧАНИЕ: Лигатуры не должны быть завязаны в этот момент времени. Как только задняя часть аорты освободится, проведите вокруг нее две лигатуры. Нижняя лигатура в конечном итоге будет перевязана чуть выше бифуркации подвздошной артерии, а верхняя лигатура будет перевязана на 5 см выше предыдущей связки. Рассеките печеночный очаг. Свяжите все артерии как можно ближе к печени. Определите общий желчный проток, поместите две лигатуры близко к печени и разделите структуру. Рассеките вокруг аорты, но не разрезайте в этот момент времени. Определите и рассеките вокруг надпеченочной части аорты и наложите на нее галстук.ПРИМЕЧАНИЕ: Лигатуры не должны быть завязаны в этот момент времени. Откройте малый мешок, чтобы лед охладил поджелудочную железу. Мобилизуйте поджелудочную железу как можно меньше перед промыванием. Вводят 500 МЕ гепарина на кг донорской массы через центральную линию. Подождите 5 минут и начните сбор крови в пакеты с цитратом, фосфатом, декстрозой, физиологическим раствором, аденином, глюкозой и маннитом (CPD/SAG-M) с помощью яремного катетера. Перевяжите нижнюю лигатуру аорты, канюляцию аорты линией заподлицо над бифуркационной стяжкой подвздошной кости и закрепите канюлю верхней завязкой. Перевязывают обе почечные артерии. Перевяжите надпеченочную аорту (перекрестный зажим) после того, как будет собрано достаточное количество крови (600 мл). Введите 10 мл хлорида калия для жертвоприношения. Инициируйте промывку раствором для консервации Университета Висконсина (UW). Вырежьте отверстие в воротной вене (как можно выше) и каву для вентиляции. Поместите лед в брюшную полость. Оцените С-образную петлю поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки после промывания 1 л раствора UW. При достаточном промывании приступают к рассечению, выявлению и пережатию брыжеечных сосудов. Замедлите промывку для второго литра UW. Извлеките трансплантат поджелудочной железы и сегмент полой или подвздошной вены для расширения воротной вены.ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат поджелудочной железы удаляется вместе с селезенкой. Поместите орган в органный мешок, который помещается в бассейн, наполненный льдом. 4. Подготовка трансплантата поджелудочной железы за задним столом (рис. 2А) Удалите линию смыва с дистальной части аорты и закройте галстуком. Наполните органный мешок оставшимся раствором UW. Освободите поджелудочную железу от слипшихся тканей, в том числе селезенки. Выполните расширение воротной вены с использованием ранее восстановленной полой или подвздошной вены с проленом 6-0. Канюляция воротной вены и проксимального отдела аорты с помощью редуктора 1/4 дюйма x 3/8 дюйма. Канюляция дистальной части двенадцатиперстной кишки с помощью катетера Malecot и галстука. Зажмите конец катетера, чтобы избежать пролития содержимого двенадцатиперстной кишки. Наблюдал за брыжеечными сосудами с 4-0 Проленом. Зарегистрируйте вес трансплантата. Храните привой в статическом холодильном хранилище (SCS) до начала НЭЭС. 5. Нормотермическая перфузия поджелудочной железы ex vivo (NEVPP) ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионный контур выполнен из неонатального сердечно-легочного шунтирования (рис. 3). Присоедините соответствующую трубку к оксигенатору и к венозному резервуару, а также артериальную линию к оттоку оксигенатора и поместите пузырьковый фильтр в его держатель. Подсоедините линию продувки, идущую от пузырькового фильтра, к венозному резервуару. Откройте крышку пузырькового фильтра, чтобы выпустить весь воздух. Соедините венозную линию с входом в венозный резервуар. Подсоедините диализный фильтр и трубку, в которую будет вливаться диализат. Подключите датчик расходомера, линии давления и датчик температуры. Подсоедините линии для отбора артериальных и венозных проб к портам для образцов. Поместите камеру поджелудочной железы (рис. 3) на стол Майонеза и введите артериальную и венозную трубку через отверстия, предназначенные для этой цели. Подключите и включите внешний нагревательный блок. Поместите всасывающую трубку внутрь роликового насоса и подсоедините один конец к трубке, выходящей из камеры, для сбора жидкости, а другой конец к венозному резервуару, чтобы собрать все потери перфузата. Подсоедините кислородную трубку (зеленую) к газовому баллону, содержащему углеводную смесь (95% O 2/5% CO2) и оксигенатору. Подсоедините трубку насосного агрегата нагревателя к оксигенатору. Зажимают линии артериального и венозного оттока, а также оттока венозного резервуара. 6. Подготовка перфузата и грунтовка контура Наполните венозный резервуар перфузатом (табл. 1). Используйте один шприцевой насос для непрерывного введения вазодилататора (эпопростенола) в дозе 8 мл / ч в артериальную линию. Используйте второй шприцевой насос для непрерывного введения ингибитора фермента непосредственно в венозный резервуар (15 мг, 10 мл / ч). Включите аппарат искусственного кровообращения (HLM) и включите панели давления, температуры и таймера. Включите насос нагревателя, чтобы нагреть перфузионный раствор до 38 °C. Откройте подачу O 2 / CO2. Снимите зажим трубки, расположенный на выходе из венозного резервуара, запустите центробежный насос и разгоните его до 1,500 об/мин. Зажмите трубку, минуя артериальный фильтр, и выпустите воздух из артериального фильтра. Обнулите линии артериального и венозного давления. 7. Перфузия трансплантата поджелудочной железы (рис. 2B) Откройте органный мешок, где хранится поджелудочная железа. Промыть 200 мл альбумина через артериальную канюлю. Извлеките поджелудочную железу изо льда и расположите внутри камеры органа. Убедитесь, что артериальная и венозная трубки свободны от воздуха. Отпустите зажим со стороны артерии и зажмите короткий путь между артериальной и венозной трубкой. Как только кровь начнет выходить из артериальной трубки, подключите линию к артериальной канюле. Установите артериальное давление на 20-25 мм рт.ст., регулируя скорость центробежного насоса. Подключите венозную трубку, как только кровь начнет выходить из венозной канюли. Вводите один флакон верапамила (2,5 мг / мл) непосредственно на артериальную сторону, когда поджелудочная железа полностью соединена и серьезных кровотечений не наблюдается. Непрерывно регистрируйте давление, артериальный кровоток, температуру и секрецию двенадцатиперстной кишки. Собирайте кровь, записывайте выход двенадцатиперстной кишки каждый час и ежечасно макроскопически оценивайте отек. Запишите параметры перфузии и возьмите образцы для анализа (образцы газов венозной и артериальной крови, а также образцы на амилазу, липазу и ЛДГ). Отсоедините артериальную и венозную трубки, когда перфузия закончится, извлеките трансплантат из камеры органа, промойте холодным UW и взвесьте. Храните трансплантат на льду в стерильном органном пакете до момента трансплантации.