Perfusion pancréatique ex vivo normamère pour la conservation des allogreffes de pancréas avant transplantation

Tous les animaux utilisés pour cette étude ont reçu des soins sans cruauté conformément aux « Principes de soin des animaux de laboratoire » formulés par la Société nationale pour la recherche médicale et au « Guide pour le soin des animaux de laboratoire » publié par les National Institutes of Health, Ontario, Canada. Toutes les études ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Toronto General Research Institute. REMARQUE : Ce protocole d’étude est basé sur un modèle porcin. Le greffon est conservé au froid pendant 2 h puis subit une perfusion machine normotherme pendant 3 h avant la transplantation (Figure 1). 1. Animaux Utilisez des porcs Yorkshire mâles (40-50 kg). 2. Prélèvement d’organes NOTE: La procédure préopératoire et une partie de l’intervention chirurgicale sont les mêmes que les articles précédents publiés par notre groupe15 et sont les suivantes: Hébergez les porcs dans l’installation de recherche pendant au moins 7 jours pour permettre l’acclimatation et réduire leur niveau de stress. Jeûner les porcs pendant au moins 6 heures avant l’induction de l’anesthésie. Sédater le porc par injection intramusculaire (IM) de midazolam (0,15 mg/kg), de kétamine (25 mg/kg) et d’atropine (0,04 mg/kg).REMARQUE: Cela se fait dans l’établissement de logement. Transférez l’animal de l’installation de logement à la salle d’opération, où la récupération de l’organe sera effectuée. Placez le porc en décubitus dorsal sur la table d’opération et placez un masque facial avec 2 L d’oxygène et 5 % d’isoflurane jusqu’à ce que la mâchoire soit détendue. Visualisez les cordes vocales à l’aide d’un laryngoscope et vaporisez-les avec 2% de lidocaïne pour prévenir les spasmes pendant l’intubation. Remplacez le masque par de l’oxygène et de l’isoflurane pendant au moins 30 s avant de tenter l’intubation. Introduisez un tube endotrachéal de 7 mm et bloquez le brassard avec 5 ml d’air. Utilisez la capnométrie pour vous assurer que le tube est dans la bonne position. Diminuer le gaz isoflurane à 2,5%. Allumez le ventilateur et réglez-le à 15-20 respirations/min et le volume courant à 10-15 mL/kg de poids corporel. Surveillez constamment la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène. En utilisant la technique Seldinger 16, introduire un cathéter de 8,5 Fr. x10 cm dans la veine jugulaire (droite ou gauche). Utilisez le cathéter de la veine jugulaire pour commencer une perfusion de fentanyl (2,5 mL dans 500 mL de Ringer) à 250 mL/h. Vérifiez les réflexes musculaires pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. Le tonus de la mâchoire est le réflexe musculaire le plus fiable 17.REMARQUE : Si la rigidité des muscles mandibulaires est notée, augmenter la perfusion d’isoflurane et/ou de fentanyl. 3. Intervention chirurgicale Désinfectez et couvrez le champ chirurgical. Effectuer une incision médiane de la xyphoïde à la symphyse pubienne. Étendez le champ chirurgical avec une incision latérale gauche pour une meilleure exposition. Disséquer la veine cave inférieure (IVC) de l’aorte abdominale. Libérez davantage l’aorte des tissus environnants et ligaturez les petites branches aortiques lombaires. Identifier et placer des ligatures autour des deux artères rénales.REMARQUE: Les ligatures ne doivent pas être attachées à ce moment-là. Une fois que l’arrière de l’aorte est libre, passez deux ligatures autour d’elle. La ligature inférieure sera finalement attachée juste au-dessus de la bifurcation de l’artère iliaque et la ligature supérieure sera attachée 5 cm au-dessus de la cravate précédente. Disséquer le hile hépatique. Attachez toutes les artères aussi près du foie que possible. Identifiez le canal cholédoque, placez deux ligatures près du foie et divisez la structure. Disséquer autour de l’aorte mais ne pas couper à ce moment-là. Identifier et disséquer autour de la partie suprahépatique de l’aorte et placer une attache autour d’elle.REMARQUE: Les ligatures ne doivent pas être attachées à ce moment-là. Ouvrez le sac inférieur pour permettre à la glace de refroidir le pancréas. Mobilisez le pancréas le moins possible avant de rincer. Administrer 500 UI d’héparine par kg de poids du donneur par le cathéter central. Attendez 5 minutes et commencez le prélèvement sanguin dans des poches de citrate, de phosphate, de dextrose, de solution saline, d’adénine, de glucose et de mannitol (CPD/SAG-M) à l’aide du cathéter jugulaire. Attachez la ligature aortique inférieure, canulez l’aorte avec une ligne affleurante au-dessus de la liaison de bifurcation iliaque et fixez la canule avec une attache supérieure. Liréger les deux artères rénales. Attachez l’aorte suprahépatique (pince croisée) une fois que suffisamment de sang a été recueilli (600 mL). Administrer 10 mL de chlorure de potassium pour le sacrifice. Initiez une solution de préservation flush avec l’Université du Wisconsin (UW). Coupez une ouverture dans la veine porte (aussi haute que possible) et du cava pour la ventilation. Placez de la glace dans la cavité abdominale. Évaluer la queue du pancréas et la boucle C du duodénum après avoir rincé 1 L de solution UW. Si le rinçage est adéquat, commencer la dissection, identifier et serrer les vaisseaux mésentériques. Ralentissez le rinçage pour le deuxième litre d’UW. Récupérer le greffon pancréatique et un segment de cava ou de veine iliaque pour l’extension de la veine porte.NOTE: La greffe pancréatique est enlevée avec la rate. Placez l’orgue dans un sac d’orgue qui est placé à l’intérieur d’une bassine remplie de glace. 4. Préparation de la greffe pancréatique (Figure 2A) Retirez la ligne de chasse de la partie distale de l’aorte et fermez avec une attache. Remplissez la poche d’organe avec le reste de la solution UW. Libérez le pancréas du tissu adhérent, y compris la rate. Effectuer une extension de la veine porte en utilisant le cava ou la veine iliaque précédemment récupérés avec 6-0 Prolene. Canuler la veine porte et l’aorte proximale avec un réducteur de 1/4 po x 3/8 po. Canuler la partie distale du duodénum avec le cathéter Malecot et attacher. Serrez l’extrémité du cathéter pour éviter le déversement du contenu duodénal. Supervision des vaisseaux mésentériques avec 4-0 Prolene. Enregistrer le poids du greffon. Conservez le greffon dans un entrepôt frigorifique statique (SCS) jusqu’au début du NEVPP. 5. Perfusion du pancréas ex vivo normamère (NEVPP) REMARQUE : Le circuit de perfusion est constitué d’un appareil de pontage cardiopulmonaire néonatal (Figure 3). Fixez le tube correspondant à l’oxygénateur et au réservoir veineux, ainsi que la ligne artérielle à la sortie de l’oxygénateur et placez le filtre à bulles dans son support. Connectez la ligne de purge qui va du filtre à bulles au réservoir veineux. Ouvrez le bouchon du filtre à bulles pour laisser sortir tout l’air. Connectez la conduite veineuse à l’entrée du réservoir veineux. Connectez le filtre de dialyse et le tuyau où le dialysat sera perfusé. Connectez le capteur de débitmètre, les conduites de pression et la sonde de température. Connectez les conduites d’échantillonnage artérielles et veineuses aux orifices d’échantillonnage. Placer la chambre pancréatique (Figure 3) sur une table Mayo et introduire le tube artériel et veineux à travers les trous prévus à cet effet. Connectez et allumez l’unité de chauffage externe. Placez le tuyau d’aspiration à l’intérieur de la pompe à rouleaux et connectez une extrémité dans le tube qui sort de la chambre pour recueillir les fluides, et l’autre extrémité au réservoir veineux pour recueillir toutes les pertes de perfusat d’organes. Raccordez le tube d’oxygène (vert) au réservoir de gaz contenant le mélange de carbogènes (95% O 2/5% CO2) et l’oxygénateur. Connectez le tube de la pompe chauffante à l’oxygénateur. Collier de serrage des conduites d’écoulement artériel et veineux, ainsi que l’écoulement du réservoir veineux. 6. Préparation du perfusat et amorçage du circuit Remplir le réservoir veineux avec le perfusat (tableau 1). Utiliser une pompe à seringue pour l’administration continue du vasodilatateur (époprosténol) à 8 mL/h dans le cathéter artériel. Utiliser une deuxième pompe à seringue pour l’administration continue de l’inhibiteur enzymatique directement dans le réservoir veineux (15 mg, 10 mL/h). Allumez l’appareil cardiaque pulmonaire (HLM) et démarrez les panneaux de pression, de température et de minuterie. Allumez la pompe chauffante pour chauffer la solution de perfusion à 38 °C. Ouvrez l’alimentation O 2/CO2. Retirez la pince de tuyauterie placée sur le débit sortant du réservoir veineux, démarrez la pompe centrifuge et portez-la jusqu’à 1 500 tr/min. Serrez le tube, en contournant le filtre artériel et libérez l’air du filtre artériel. Zéro les conduites de pression artérielle et veineuse. 7. Perfusion du greffon pancréatique (figure 2B) Ouvrez le sac d’organes où le pancréas est stocké. Rincer avec 200 ml d’albumine par la canule artérielle. Retirez le pancréas de la glace et placez-le à l’intérieur de la chambre de l’organe. Confirmer que l’artère et la tubulure veineuse sont exemptes d’air. Relâchez la pince du côté artériel et serrez le raccourci entre le tube artériel et veineux. Une fois que le sang commence à sortir de la tubulure artérielle, connectez-vous à la canule artérielle. Réglez la pression artérielle à 20-25 mmHg, en régulant la vitesse de la pompe centrifuge. Connectez la tubulure veineuse une fois que le sang commence à sortir de la canule veineuse. Administrer un flacon de vérapamil (2,5 mg/mL) directement du côté artériel, lorsque le pancréas est complètement connecté et qu’aucun saignement majeur n’est observé. Enregistrer les pressions, le débit artériel, la température et la sécrétion du duodénum en continu. Prélever du sang, enregistrer le débit duodénal toutes les heures et évaluer macroscopiquement l’œdème toutes les heures. Enregistrer les paramètres de perfusion et prélever des échantillons pour analyse (échantillons de gaz du sang veineux et artériel, ainsi que des échantillons d’amylase, de lipase et de LDH). Débranchez les tubes artériels et veineux lorsque la perfusion est terminée, retirez le greffon de la chambre de l’organe et rincez avec de l’UW froid et pesez. Conservez le greffon sur de la glace dans un sac d’organe stérile jusqu’au moment de la transplantation.