Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Aşağıda detaylandırılan protokol(ler)in tüm adımları, Cleveland Clinic Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Protokolü #2559 ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) onayı #1711’e uygun olarak geliştirilmiş ve yürütülmüştür. Küreler ve organoidler “Neurobazal Media Complete” (NBMc) ‘de kültürlenir. Talimatlar için Tablo 1’e bakın. 1. Organoid kalıpların yapımı Balmumu kağıdını parafilm tabakasından çıkarın (kabaca 4 cm x 4 cm boyutlarında) ve iki steril 96 delikli polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakası arasına yerleştirin.Bu adımları kültür davlumbazında uygulayın ve parafilmin “içini” (kağıdın kapladığı taraf) temiz tutmak için özel dikkat gösterin. Bu temiz taraf, girintilerin konkavitesini yapmalıdır. Parafilmde küçük çukurlar oluşturmak için üst 96 delikli PCR plakasına eşit basınç uygulayın. Amaç, gamzelerin parafilmde delik açmadan kabaca 2 mm derinlikte olmasını sağlamaktır. İki adet 96 delikli PCR plakasını nazikçe ayırın. Çukurlu parafilm üst plakaya yapışacaktır. Bunu yaklaşık 30 s boyunca kuru buz üzerine yerleştirin. Parafilm 30 sn boyunca kuru buz üzerinde kaldıktan sonra, parafilmi üst 96 kuyucuklu PCR plakasından çekmek için steril forseps kullanın.Parafilmi çıkarırken, çok “dikkatli” olmak yerine hızlı bir hareket kullanın. Dondurulmuş parafilmin, ısıtılmış parafilmden daha kolay çıkarılması, çukurların tersine dönmesine neden olabilir. Tamamlanan parafilm kalıbını kaplı, steril 10 cm’lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Kalıplar önceden yapılabilir ve sterilite korunursa saklanabilir. 2. Hasta doku örneğinin makrodiseksiyonu Steril bir kültür kabında (10 cm’lik hücre kültürü plakaları), eşit basınç uygularken hasta örneğini ince bir şekilde kesmek için iki steril tıraş bıçağı kullanın.NOT: Numuneyi kıymak, kültür kabı üzerinde yaklaşık 500 μL NBMc ile en kolay olanıdır. Parçaları mümkün olduğunca ince kıymak için tıraş bıçağı ile deneyin; İdeal olarak, tek tek parçalar 1mm3 veya daha küçüktür. İnce kıyılmış tümör parçalarını, kesilmiş bir p1000 pipet ucu kullanarak 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın.NOT: Organoidleri tutarken, yalnızca kesilmiş p1000 pipet uçlarının kullanılması önemlidir. Bunlar, istenen açıklık boyutuna (kabaca 5 ila 8 mm arasında) keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak kesilebilir ve otoklavlanabilir. 2 mL oda sıcaklığı (RT) hücre ayırma çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve yaklaşık 10 dakika boyunca 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.NOT: Birkaç dakikada bir gözlemleyin ve karıştırın. Bazı hücre ayrılma çözeltileri veya numuneleri değişen kuluçka sürelerine ihtiyaç duyabilir. Hücre lizisi nedeniyle DNA salınımını gösterebilen kümelenme ortaya çıkarsa, hemen bir sonraki adıma geçin. Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için 8 mL NBMc ortamı ekleyin ve 65 x g’de 3 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı aspire edin ve dokuyu 1-2 mL NBMc’de yeniden askıya alın. 3. Primer hasta dokusundan organoidlerin üretilmesi NOT: Primer hasta dokusundan organoid yaparken amaç üç boyutlu kültür oluşturmaktır. Tek hücreler için filtre uygulamayın veya hücreleri saymayın, ancak görsel inceleme kullanarak ilk hücre yükünü mümkün olduğunca eşit tutun. İlk organoidlerin büyümesinde ve oluşumunda heterojenliğe sahip olmak normaldir. Her organoid, hacim olarak 20 μL (16 μL laminin bakımından zengin hücre dışı matriks (lrECM) ve adım 2.5’ten itibaren NBMc’de askıya alınmış 4 μL doku olacaktır). Talimatlar, amaçlanan organoid sayısına göre ayarlanabilir; Amaç, tipik olarak birincil hasta örneklerinden yaklaşık 20-30 organoid oluşturmaktır. Bir buz kovasına veya soğuk bloğa, lrECM’yi ve küçük bir santrifüj tüpünü yerleştirin. Küçük santrifüj tüpüne uygun miktarda lrECM (16 μL x X sayıda amaçlanan organoid) yerleştirin. Buz üzerindeki santrifüj tüpüne adım 2.5’ten (4 μL x amaçlanan organoid sayısı) uygun miktarda doku süspansiyonu ekleyin. lrECM/hücre süspansiyon karışımının 20 μL’sini parafilm kalıplarına dikkatlice pipetleyin; bu inci benzeri bir damlacık oluşturacaktır.LRECM/hücre süspansiyon karışımını iyice karıştırdığınızdan emin olun; hücreler lrECM içinde kolayca yerleşme eğilimindedir ve bu da heterojen organoidlere neden olur. LRECM/hücre süspansiyon karışımını buz üzerinde tutun. LRECM ısınırsa, polimerize olabilir ve organoid oluşumunu tehlikeye atabilir. LrECM polimerizasyonunu önlemek için pipet ucunu her iki ila üç organoidde bir soğuttuğunuzdan emin olun. Organoidlere hava kabarcıkları sokmayın (pipeti “çift itmekten” kaçının). İstenilen sayıda organoid, 10 cm’lik bir hücre kültürü plakasında parafilm kalıbına pipetlendikten sonra, plaka kapağı ile örtün ve 37 ° C’de bir hücre kültürü inkübatöründe 1-2 saat boyunca% 5 CO2 inkübe edin. Organoidler katılaştıktan sonra, NBMc ortamını kullanarak onları parafilm kalıbından nazikçe temizleyin ve 20 mL NBMc toplamına sahip yeni, steril 10 cm’lik bir kültür plakasına yerleştirin. Bir p1000 ucu kullanmak, organoidleri kalıptan temizlemek için en iyi sonucu verir; nazikçe kayacaklar.NOT: Organoidler kalıplardan hücre kültürü plakalarına yıkandığında, ortamda küçük pembe küreler halinde görünmelidir. Organoidler medyada parçalanmış veya parçalanmış gibi görünüyorsa, bu, lrECM’nin polimerize olmasıyla ilgili daha erken bir sorunu gösterir ve organoidler hala büyüyebilir, ancak boyut olarak eşit olmaları pek olası değildir. 10 cm’lik kültür kabını 4 gün boyunca 37 °C’de,% 5 CO2’de (sallanmadan) bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.NOT: Organoidleri ilk günlerde yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirmek, parçalanmalarına neden olabilir. 4. güne kadar titremediklerinden emin olun. 4 gün sonra, medyayı değiştirin ve 37 ° C’de,% 5 CO2’de bir hücre kültürü inkübatöründe 80 RPM’de bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.Olgunlaşmamış organoidlerle medya alışverişi zordur çünkü görselleştirmeleri zordur. Hücre kültürü kabını eğin ve en az 20 s bekleyin; organoidler alta yerleşecek ve yukarıdan gelen ortamın cam veya plastik 10-20 mL pipetle yavaşça çıkarılmasına izin verecektir. Alttaki organoidlerin toplanmasına dikkat edin; medyanın kaldırılmasının gücüyle karıştırılmış görünüyorlarsa, duraklatmak ve yeniden yerleşmelerine izin vermek en iyisidir. Organoidler olgunlaştıkça ve görselleştirilmesi daha kolay hale geldikçe, bu süreç daha az nüanslı hale gelir.NOT: Bazen, hücre kültürü plakasının altına bir parça koyu renkli kağıt yerleştirmek, olgunlaşmamış organoidleri görselleştirmeye yardımcı olabilir. Organoidlerin bu şekilde emilmesi ve kaybolması çok kolay olduğundan, ortamları çıkarmak için vakum emişli bir Pasteur pipeti kullanılmaması önerilir. Organoidler ilk kurulduğunda, olgun organoidler kadar hızlı bir şekilde ortam tüketmezler. medya değişiminden başlayarak gereksiz medya kullanımını azaltır ve medya değişim işlemi sırasında yanlışlıkla yeni organoidlere zarar verme veya aspire etme olasılığını azaltır. 4. Yerleşik GBM küresinden, yapışkan veya organoid kültüründen organoidler üretmek NOT: Buradaki amaç, karşılaştırmalı deneylerde kullanılmak üzere boyut ve hücre miktarında tek tip organoidler yapmaktır, bu nedenle bunu sağlamak için tek hücreli bir filtre kullanın ve hücreleri sayın. GBM küre kültüründen tek hücreli süspansiyonun hazırlanması.NOT: GBM hücrelerinin küre kültürleri NBMc ortamında tutulur.Küreleri 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 5 dakika boyunca 120 x g’de döndürün. Süpernatantı çıkarın ve 2 mL RT hücre ayırma çözeltisi ekleyin. 37 °C’lik bir inkübatöre 3 dakika yerleştirin. Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için 8 mL NBMc ortamı ekleyin. Tek hücreli süzgeçten (70 μm) süzün ve 120 x g’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı tüpten çıkarın ve kalan hücreleri ~ 1 mL NBMc’de yeniden askıya alın. hücreleri sayın (hücre geçirimsiz leke kullanarak) ve adım 4.4’e atlayın. GBM yapışkan kültürden tek hücreli süspansiyonun hazırlanması.Kullanılan ortamı plakadan çıkarın, plakaya 2 mL RT hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 3 dakika boyunca 37 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Mikroskop altında hücrelerin plakadan ayrıldığını onaylayın. Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için 8 mL NBMc ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süzgeçten (70 μm) süzün.NOT: Tek hücreli süzme, yapışkan kültürle çalışırken isteğe bağlıdır. 120 x g’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı tüpten çıkarın ve kalan hücreleri ~ 1 mL NBMc’de yeniden askıya alın. hücreleri sayın (hücre geçirimsiz leke kullanarak) ve adım 4.4’e atlayın. GBM organoid kültüründen tek hücreli süspansiyonun hazırlanması.Organoidleri kesilmiş bir p1000 pipet ucu kullanarak 10 cm’lik bir kültür plakasına aktarın ve mümkün olduğunca fazla kalıntı ortamı dikkatlice çıkarın. İki steril tıraş bıçağı kullanarak, organoidleri dikkatlice ince ince doğrayın. Kesilmiş p1000 ucu ile kıyılmış organoidleri 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne taşıyın ve ~2-3 mL NBMc ortamı ekleyin. 3 dakika boyunca 120 x g’de döndürün ve süpernatantı çıkarın (bu parça için vakum emiş yerine bir pipet ucu kullanmanızı öneririz). 10 dakika boyunca 2 mL soğuk hücre ayırma çözeltisi ekleyin.NOT: Hücre ayırma çözeltisi doğrudan 4 °C’den kullanılmalı, önce ısıtılmamalıdır. Bu, kalan herhangi bir matrijeli yumuşatır ve hücre iyileşmesine yardımcı olur. Daha sonra 10-20 dakika boyunca 37 ° C’lik bir inkübatöre geçin, birkaç dakikada bir gözlemleyin ve karıştırın. Hücre lizisini gösterebilecek kümelenme görülürse, hemen bir sonraki adıma geçin. Hücre ayrılma çözeltisini seyreltmek için 8 mL NBMc ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süzgeçten (70 μm) süzün ve 120 x g’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı tüpten çıkarın ve kalan hücreleri ~ 1 mL NBMc’de yeniden askıya alın. hücreleri sayın (hücre geçirimsiz leke kullanarak) ve adım 4.4’e geçin. Tek hücreli süspansiyondan organoid yapımıBir buz kovasına veya soğuk bloğa, lrECM’yi ve küçük bir santrifüj tüpünü yerleştirin. Küçük santrifüj tüpüne uygun miktarda lrECM (16 μL x X sayıda amaçlanan organoid) yerleştirin. 20.000 hücre/organoid içerecek toplam hacimde (4 μL x X sayıda amaçlanan organoid) bir hücre karışımı oluşturun ve bunu buz üzerinde lrECM bulunan küçük santrifüj tüpüne ekleyin. lrECM/hücre süspansiyon karışımının 20 μL’sini parafilm kalıplarına dikkatlice pipetleyin; bu inci benzeri bir damlacık oluşturacaktır.LrECM / hücre süspansiyon karışımını iyice karıştırdığınızdan emin olun, çünkü hücreler lrECM içinde kolayca yerleşme eğilimindedir ve bu da heterojen organoidlere neden olur. LRECM/hücre süspansiyon karışımını buz üzerinde tutun. LRECM ısınırsa, polimerize olabilir ve organoid oluşumunu tehlikeye atabilir. LrECM polimerizasyonunu önlemek için pipet ucunu her iki ila üç organoidde bir soğuttuğunuzdan emin olun. Organoidlere hava kabarcıkları sokmayın (pipet ucunu “çift itmekten” kaçının). İstenilen sayıda organoid 10 cm’lik bir kültür plakasında parafilm kalıbına pipetlendikten sonra, bir hücre kültürü inkübatöründe 1-2 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Organoidler katılaştıktan sonra, NBMc ortamını kullanarak onları parafilm kalıbından nazikçe temizleyin ve 20 mL NBMc toplamına sahip yeni, steril 10 cm’lik bir kültür plakasına yerleştirin. Bir p1000 ucu kullanmak, organoidleri kalıptan temizlemek için en iyi sonucu verir; nazikçe kayacaklar.NOT: 10 cm’lik kültür kabı başına yaklaşık 15-20 organoid önerilir. 10 cm’lik kültür kabını 4 gün boyunca bir inkübatöre (sallanmadan) yerleştirin. 4 gün sonra, medyayı değiştirin ve hücre kültürü inkübatöründe 80 RPM’de bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Bundan sonra her 2-3 günde bir medya alışverişinde bulunun.Olgunlaşmamış organoidlerle medya alışverişi zordur çünkü görselleştirmeleri zordur. Hücre kültürü kabını eğin ve en az 20 s bekleyin; organoidler alta yerleşecek ve yukarıdan gelen ortamın büyük bir açılan cam pipetle yavaşça çıkarılmasına izin verecektir. Alttaki organoidlerin toplanmasına dikkat edin; medyanın kaldırılmasının gücüyle karıştırılmış görünüyorlarsa, duraklatın ve yeniden yerleşmelerine izin verin. Organoidler olgunlaştıkça ve görselleştirilmesi daha kolay hale geldikçe, bu süreç daha az nüanslı hale gelir.NOT: Bazen, hücre kültürü plakasının altına bir parça koyu renkli kağıt yerleştirmek, olgunlaşmamış organoidleri görselleştirmeye yardımcı olabilir. Ortamları çıkarmak için vakum emişli bir Pasteur pipet kullanmayın, çünkü organoidlerin bu şekilde emilmesi ve kaybolması çok kolaydır. Organoidler ilk kurulduğunda, olgun organoidler kadar hızlı bir şekilde ortam tüketmezler. Gereksiz medya kullanımını azaltmak ve medya değişim işlemi sırasında yanlışlıkla yeni organoidlere zarar verme veya aspire etme olasılığını azaltmak için medya değişimi ile başlayın. 5. Kriyoembedding Her organoidi, 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren ayrı bir 1,5 mL tüpe (kesilmiş p1000 ucu kullanılarak) yerleştirin. Organoidleri gece boyunca 4 °C’de saklayın. Organoidleri parafine gömüyorsanız, bölüm 6’ya geçin. % 4 PFA’da gece boyunca sabitlendikten sonra, organoidleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde üç kez yıkayın. Organoidi, suda 1 mL% 30 sakkaroz içeren yeni bir 1,5 mL tüpe (kesilmiş p1000 pipet ucu kullanılarak) aktarın ve gece boyunca 4 ° C’de saklayın. Bir kriyomolda az miktarda (tipik olarak 1-2 mL) optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ekleyin, tabanı örtün ve kalıbın derinliğinin yaklaşık 1 / 3 ila 1 / 2’sini doldurun. Kesilmiş p1000 pipet ucunu kullanarak tek bir organoidi cryomold’a aktarın. Bu, bazı ortamların organoid ile aktarılmasına neden olur, bu da kaçınılmazdır. Organoidi rahatsız etmeden çevredeki ortamları dikkatlice çıkarmak için daha küçük bir pipet ucu kullanın.NOT: Bunu görselleştirmek zor olabilir, ancak yavaş pipetleme, ortam ile OCT arasındaki yoğunluklarda net bir fark gösterecektir, bu nedenle bu bir dereceye kadar “hissederek” yapılır). Cryomold’u kuru buz tepsisine yerleştirin. OCT donmaya başlayacak ve süreçte opak hale gelecektir. Organoidi tamamen örtmek için ek OCT ekleyin ve kriyomoldun hacminin geri kalanını doldurun. Bloklar birkaç gün boyunca kısa süreli depolama için -20 ° C’de veya süresiz olarak uzun süreli depolama için -80 ° C’de saklanabilir. 6. Parafin gömme Organoidleri boyutlarına göre sıralayın (küçük organoidler 3 mm’nin altında, büyük organoidler 3 mm’nin üzerindedir). Her organoidi kesilmiş bir p1000 pipet ucu kullanarak bir histoloji kasetine aktarın ve Tablo 2 veya Tablo 3’e göre parafin balmumu haline getirin.NOT: Histoloji kasetinin boyutu/yapılandırması kullanıcıya bağlıdır. Organoidleri kasetlerden 1-2 mL erimiş parafin mumu ile kalıpları gömmeye aktarın ve balmumu yarı katı olana kadar soğutun. Balmumu kısmen katılaştıktan sonra, kalıbın üstüne daha fazla balmumu ekleyin. Etiketli kaset üstünü kalıbın üzerine yerleştirin ve bunu soğuk bir plakaya aktarın. Balmumu tamamen katı olana kadar soğumaya devam edin. Balmumu katılaştığında, bloğu bir mikrotom kullanarak kesitleyin. Alternatif olarak, daha sonra bölümleme için RT veya 4 ° C’de saklayın. 7. İmmünofloresan (IF) Aşağıdaki adımlara göre, bir slayt boyama kabı kullanarak 5-12 μm parafin gömülü doku kesitlerini parafinden arındırın ve rehidre edin.NOT: OCT’ye gömülü organoidlerden bölümler kullanıyorsanız, 12 μm kesitler kullanmanızı öneririz. PBS’deki slaytı 30 dakika boyunca sallayarak OCT’yi kaldırın. Adım 7.2’ye geçin.Ksilende 5 dakika kuluçkaya yatırın. Bunu iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra% 100 etanol içinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bunu bir kez daha tekrarlayın. % 95 etanolde 10 dakika inkübe edin. Bir kez daha tekrarlayın. Bölümleri damıtılmış suda 5 dakika, iki kez yıkayın. Antijen maskesini kaldırmak için, slaytları 1x sitrat maskeleme çözeltisine (Malzeme Tablosu) batırın ve 10 dakika boyunca kaynama sıcaklığında mikrodalga fırına batırın. Çözeltinin kaynamasına izin vermediğinizden emin olun.NOT: Bu, kaynama meydana gelene kadar başlangıçta ~ 2 dakika boyunca mikrodalgada pişirilirse, daha sonra çözeltinin kaynamamasını sağlamak için gücü düşürür ve izlerse en iyi şekilde elde edilir. Tercih edilen maskeyi kaldırma sıcaklığı 100 °C’nin hemen altında, ideal olarak 98 °C’dir. 1x sitrat maskeyi kaldırma çözümünde slaytları RT’de 30 dakika soğumaya bırakın.NOT: Bu aynı 1x sitrat çözeltisidir; çözümün bu adımda değiştirilmesi gerekmez. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika, iki kez yıkayın. Slaytları 5 dakika boyunca 1x TBST (% 0,1 Aralık 20 ile Tris tamponlu salin) tamponunda yıkayın. Slaytları TBST’den çıkarın ve doku bölümünün kurumasına izin vermemeye dikkat ederken laboratuvar temizleme mendili kullanarak doku bölümlerinin etrafında dikkatlice kurulayın. Slayt yeterince kuruduktan sonra, hidrofobik bariyer kalemi ile doku bölümlerini daire içine alın. Her bölümü RT’de 1 saat boyunca 100-400 μL% 10 serum bloke edici çözelti ile bloke edin. Örneğin, eşek içinde yapılan ikincil bir antikor kullanıyorsanız, 1x TBST’de% 10’luk normal bir eşek serumu kullanın. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve daha sonra bloke edici çözeltide istenen konsantrasyona seyreltilmiş 100-400 μL birincil antikor ekleyin. 4 ° C’de, bölümleri gece boyunca birincil antikor ile inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve slaytları 1x TBST’de 5 dakika, üç kez yıkayın. Her bölüme 100-400 μL sekonder antikor (blokaj çözeltisinde veya üreticinin talimatlarına göre 1:1000 seyreltme) ekleyin ve RT’de 1,5 saat inkübe edin. Slaytları 1x TBST’de 5 dakika, iki kez yıkayın. Ardından slaytları 5 dakika boyunca 1x PBS’de yıkayın. Slaytları PBS’den çıkarın ve laboratuvar temizleme mendili kullanarak doku kesitlerinin etrafında kurulayın. Birkaç damla sıvı kürleme montajı ekleyin ve bir cam kapak kapağını dikkatlice monte edin. Slaytlar kuruduktan sonra, görüntülemeye hazır olana kadar ışıktan korunan -20 °C’de saklayın. 8. İmmünohistokimya Aşağıdaki adımlara göre, bir slayt boyama kabı kullanarak parafin gömülü doku bölümlerini parafinden arındırın ve yeniden sulandırın.NOT: OCT’ye katıştırılmış organoidlerden bölümler kullanıyorsanız, slaytı PBS’de 30 dakika boyunca sallayarak OCT’yi kaldırın. Adım 8.2’ye geçin.Ksilende 5 dakika kuluçkaya yatırın. İki kez daha tekrarlayın. % 100 etanolde 10 dakika inkübe edin. Bir kez daha tekrarlayın. % 95 etanolde 10 dakika inkübe edin. Bir kez daha tekrarlayın. Bölümleri damıtılmış suda 5 dakika, iki kez yıkayın. Antijen maskesini kaldırmak için, slaytları 1x sitrat maskeleme çözeltisine batırın ve 10 dakika boyunca alt kaynama sıcaklığında mikrodalga fırına batırın. Çözeltinin kaynamasına izin vermediğinizden emin olun. 1x sitrat maskeleme çözümünde slaytları RT’de 30 dakika soğumaya bırakın. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytları% 3 hidrojen peroksitte 10 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları iki kez damıtılmış suda 5 dakika yıkayın. Slaytları 1x TBST’de 5 dakika yıkayın. Slaytları 1x TBST’den çıkarın ve ardından doku bölümlerinin etrafını dikkatlice kurutmak için laboratuvar temizleme mendilinin köşesini kullanın. Slayt kuruduktan sonra doku bölümlerini hidrofobik bir bariyer kalemle çevreleyin. RT’deki hidrofobik bariyer kalem çemberi içindeki her bölüme 100-400 μL blokaj çözeltisini 1 saat boyunca yerleştirin. 1x TBST’de seyreltilmiş normal eşek serumu (NDS) veya %0.75 sığır serum albümini (BSA) kullanın. Daha sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve her bölüme 100-400 μL birincil antikor ekleyin. Bu birincil antikoru, uygun üreticinin seyrelticisini kullanarak istenen konsantrasyona kadar seyreltin. Bölümleri gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve slaytları 1x TBST’de 5 dakika, üç kez yıkayın. Her bölüme 100-400 μL IHC tespit reaktifi ekleyin ve RT’de 1 saat inkübe edin. Her bölümü 5 dakika boyunca 1x TBST ile iki kez, ardından bir kez 5 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın. Üreticinin talimatlarına göre 3,3-Diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın. Her doku bölümüne 100-400 μL DAB çözeltisi ekleyin ve mikroskop altında yakından izleyin. 1-10 dakika arasında kabul edilebilir boyama yoğunluğu sağlayacaktır; bu sefer not ettiğinizden ve tüm doku bölümleri için tutarlı olduğunuzdan emin olun. İstenilen boyama yoğunluğuna ulaşıldıktan sonra, slaytları damıtılmış suya batırın. Hematoksilin karşı boyaması yapın ve Tablo 4’teki talimatlara göre montaj için dehidrasyon kaydırın. Slaytı ksilen ikamesinden (Malzeme Tablosu) çıkarın ve laboratuvar temizleme mendili kullanarak doku bölümünün etrafındaki ekstra sıvıyı silin. Kapak kaymasını doku bölümünün üzerine monte etmek ve kurumaya bırakmak için az miktarda kalıcı montaj ortamı kullanın. 9. Toplam hücre canlılığının ölçülmesi Her organoidi 2 mL’lik bir tüpe aktarın ve küçük bir pipet ucu kullanarak, organoidin etrafındaki tüm fazla ortamları dikkatlice çıkarın (bu prosedürün şeması için Şekil 3’e bakın).NOT: Hücre canlılığı testleri, aynı sayıda hücreyle yapılan organoidlerle yapılmalıdır. Bu deney, doğrudan ameliyattan alınan hasta örneklerinden, alredy biçimli organoidlerin kesilmesinden veya tek hücrelerin filtrelenmediği ve sayılmadığı diğer durumlardan yapılan organoidler üzerinde yapılmamalıdır. Işıldayan hücre canlılığı testi reaktifini ve 1: 1 oranında 1x PBS’yi hazırlayın ve her tüpe 500 μL ekleyin. Organoidi parçalamak ve 5 dakika bekletmek üzere agresif bir şekilde yukarı ve aşağı pipet çekmek için bir p1000 pipet ucu kullanın. Organoid şimdiye kadar biraz ayrışmış ve daha yumuşak olmalıdır; p1000 pipet ucuyla karıştırmayı tekrarlayın. Amaç, 96 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına toplam 100 μL hacme sahip olmaktır. Adım 9.3’ten 25 μL karışım ekleyin (çoklu teknik kopyalar için yeterli olacaktır) ve kalan ışıldayan hücre canlılığı testi ve PBS karışımından 75 μL ekleyin. Plakayı 2 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin ve ardından RT’de 20 dakika boyunca inkübe edin. Bir plaka okuyucusunda bir lüminesans ayarı kullanarak plakayı okuyun ve verileri toplayın (bkz. Şekil 4).