Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Alle unten aufgeführten Schritte des Protokolls wurden in Übereinstimmung mit dem Protokoll #2559 des Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) und der Genehmigung #1711 des Institutional Biosafety Committee (IBC) entwickelt und durchgeführt. Kugeln und Organoide werden in “Neurobasal Media Complete” (NBMc) kultiviert. Anweisungen hierzu finden Sie in Tabelle 1 . 1. Herstellung von Organoidformen Nehmen Sie das Wachspapier von der Parafilmfolie (ca. 4 cm x 4 cm groß) und legen Sie es zwischen zwei sterile 96-Well-Polymerase-Kettenreaktionsplatten (PCR).Führen Sie diese Schritte in der Kulturhaube durch und achten Sie besonders darauf, das “Innere” des Parafilms (die Seite, die vom Papier bedeckt ist) sauber zu halten. Diese saubere Seite sollte die Konkavität der Vertiefungen machen. Üben Sie gleichmäßigen Druck auf die obere 96-Well-PCR-Platte aus, um kleine Grübchen im Parafilm zu bilden. Ziel ist es, dass Grübchen etwa 2 mm tief sind, ohne Löcher im Parafilm zu erzeugen. Trennen Sie die beiden 96-Well-PCR-Platten vorsichtig. Der Noppen-Parafilm klebt an der oberen Platte. Legen Sie diese für ca. 30 s auf Trockeneis. Nachdem der Parafilm 30 s auf Trockeneis war, ziehen Sie den Parafilm mit sterilen Pinzetten von der oberen 96-Well-PCR-Platte ab.Verwenden Sie beim Entfernen des Parafilms eine schnelle Bewegung, anstatt sehr “vorsichtig” zu sein. Gefrorener Parafilm ist leichter zu entfernen als erwärmter Parafilm, was dazu führen kann, dass sich die Grübchen umkehren. Die fertige Parafilmform in eine abgedeckte, sterile 10 cm Zellkulturschale geben. Formen können im Voraus hergestellt und gelagert werden, wenn die Sterilität erhalten bleibt. 2. Makrodissektion der Patientengewebeprobe Verwenden Sie in einer sterilen Kulturschale (10 cm Zellkulturplatten) zwei sterile Rasierklingen, um die Patientenprobe unter gleichmäßigem Druck fein zu zerkleinern.HINWEIS: Das Zerkleinern der Probe ist am einfachsten mit etwa 500 μL NBMc auf der Kulturschale. Versuchen Sie mit Rasierklingen, Stücke so fein wie möglich zu zerkleinern; Idealerweise sind Einzelstücke 1 mm3 oder kleiner. Die fein zerkleinerten Tumorstücke werden mit einer geschnittenen p1000-Pipettenspitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.HINWEIS: Beim Umgang mit Organoiden ist es wichtig, nur geschnittene p1000-Pipettenspitzen zu verwenden. Diese können mit einem scharfen Rasiermesser auf die gewünschte Öffnungsgröße (zwischen 5 und 8 mm grob) zugeschnitten und autoklaviert werden. Fügen Sie 2 mL Zellablösungslösung bei Raumtemperatur (RT) hinzu (Table of Materials) und legen Sie sie für ca. 10 min in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator .HINWEIS: Alle paar Minuten beobachten und mischen. Einige Zellablösungslösungen oder -proben benötigen möglicherweise unterschiedliche Inkubationszeiten. Wenn eine Verklumpung auftritt, die auf eine DNA-Freisetzung aufgrund der Zelllyse hinweisen kann, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Fügen Sie 8 ml NBMc-Medien hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren, und drehen Sie sich für 3 min bei 65 x g. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Gewebe in 1-2 ml NBMc. 3. Organoide aus primärem Patientengewebe erzeugen HINWEIS: Das Ziel bei der Herstellung von Organoiden aus primärem Patientengewebe ist es, eine dreidimensionale Kultur zu etablieren. Filtern Sie nicht nach einzelnen Zellen oder zählen Sie Zellen, sondern halten Sie die anfängliche Zellbelastung durch visuelle Inspektion so gleichmäßig wie möglich. Es ist normal, Heterogenität im Wachstum und der Etablierung von anfänglichen Organoiden zu haben. Jedes Organoid hat ein Volumen von 20 μL (16 μL lamininreiche extrazelluläre Matrix (lrECM) und 4 μL suspendiertes Gewebe in NBMc ab Schritt 2.5). Anweisungen können für die Anzahl der beabsichtigten Organoide angepasst werden; Ziel ist es, typischerweise etwa 20-30 Organoide aus primären Patientenproben zu bilden. Legen Sie das lrECM und ein kleines Zentrifugenröhrchen in einen Eiskübel oder kalten Block. Geben Sie die entsprechende Menge lrECM (16 μL x X Anzahl der vorgesehenen Organoide) in das kleine Zentrifugenröhrchen. Geben Sie ein geeignetes Volumen der Gewebesuspension aus Schritt 2.5 (4 μL x Anzahl der vorgesehenen Organoide) in das Zentrifugenröhrchen auf Eis. 20 μL der lrECM/Zellsuspensionsmischung werden vorsichtig auf Parafilmformen pipettiert; Dadurch entsteht ein perlenartiges Tröpfchen.Achten Sie darauf, die lrECM/Zellsuspensionsmischung gründlich zu mischen; Die Zellen neigen dazu, sich leicht innerhalb der lrECM anzusiedeln, was zu heterogenen Organoiden führt. Bewahren Sie die lrECM/Zellsuspensionsmischung auf Eis auf. Wenn sich lrECM erwärmt, kann es polymerisieren und die Organoidbildung beeinträchtigen. Achten Sie darauf, die Pipettenspitze alle zwei bis drei Organoide zu kühlen, um eine lrECM-Polymerisation zu verhindern. Führen Sie keine Luftblasen in Organoide ein (vermeiden Sie ein “doppeltes Drücken” der Pipette). Sobald die gewünschte Anzahl von Organoiden in einer 10 cm Zellkulturplatte auf Parafilmform pipettiert wurde, mit Plattendeckel abdecken und in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C 5%CO2 für 1-2 h inkubieren. Nachdem die Organoide erstarrt sind, spülen Sie sie mit NBMc-Medien vorsichtig von der Parafilmform in eine neue, sterile 10 cm Kulturplatte mit insgesamt 20 ml NBMc. Die Verwendung einer p1000-Spitze funktioniert am besten, um die Organoide von der Form zu spülen. Sie werden sanft abrutschen.HINWEIS: Wenn Organoide aus den Formen in Zellkulturplatten gespült werden, sollten sie in den Medien als kleine rosa Kugeln sichtbar sein. Wenn die Organoide in den Medien auseinandergefallen oder zerbrochen zu sein scheinen, deutet dies auf ein früheres Problem mit lrECM hin, das polymerisiert wurde, und Organoide können immer noch wachsen, aber es ist sehr unwahrscheinlich, dass sie eine einheitliche Größe haben. Die 10 cm große Kulturschale 4 Tage lang bei 37 °C, 5%CO2 (ohne Schütteln) in einen Zellkulturinkubator stellen.HINWEIS: Das Platzieren von Organoiden auf einem Orbitalschüttler in den ersten Tagen kann dazu führen, dass sie auseinanderfallen. Stellen Sie sicher, dass sie bis Tag 4 nicht zittern. Nach 4 Tagen das Medium austauschen und auf einen Orbitalschüttler bei 80 U/min in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5%CO2 legen.Der Austausch von Medien mit unreifen Organoiden ist eine Herausforderung, da sie schwer zu visualisieren sind. Kippen Sie die Zellkulturschale und warten Sie mindestens 20 s; Die Organoide setzen sich am Boden ab und ermöglichen es, die Medien von oben mit einer 10-20 ml Glas- oder Kunststoffpipette langsam zu entfernen. Achten Sie sorgfältig auf die Sammlung von Organoiden am Boden; Wenn sie durch die Kraft der Medienentfernung aufgewühlt erscheinen, ist es am besten, innezuhalten und ihnen zu erlauben, sich neu anzusiedeln. Wenn Organoide reifen und leichter zu visualisieren sind, wird dieser Prozess weniger nuanciert.HINWEIS: Manchmal kann das Platzieren eines Stücks dunklem Papier unter der Zellkulturplatte helfen, unreife Organoide zu visualisieren. Es wird empfohlen, keine Pasteur-Pipette mit Vakuumabsaugung zu verwenden, um Medien zu entfernen, da die Organoide auf diese Weise sehr leicht angesaugt und verloren gehen können. Wenn Organoide zum ersten Mal etabliert werden, verbrauchen sie Medien nicht so schnell wie reife Organoide. Beginnend mit 50% Medienaustausch reduziert unnötige Mediennutzung und verringert die Wahrscheinlichkeit, dass versehentlich neue Organoide während des Medienaustauschprozesses beschädigt oder angesaugt werden. 4. Erzeugung von Organoiden aus etablierter GBM-Sphäre, adhärenter oder Organoidkultur HINWEIS: Das Ziel hier ist es, Organoide herzustellen, die in Größe und Zellmenge einheitlich für die Verwendung in Vergleichsexperimenten sind, also verwenden Sie einen Einzelzellfilter und zählen Sie Zellen, um dies sicherzustellen. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus GBM-Kugelkultur.HINWEIS: Kugelkulturen von GBM-Zellen werden in NBMc-Medien gepflegt.Die Kugeln in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und mit 120 x g für 5 min drehen. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml RT-Zellablösungslösung hinzu. 3 min in einen 37 °C heißen Inkubator stellen. Fügen Sie 8 ml NBMc-Medien hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren. Durch ein Einzelzellsieb (70 μm) abseihen und 5 min bei 120 x g schleudern. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie die verbleibenden Zellen in ~ 1 ml NBMc. Zählen Sie die Zellen (unter Verwendung der Zellimpermeant Färbung) und fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus GBM-adhärenter Kultur.Entfernen Sie die verwendeten Medien von der Platte, geben Sie 2 ml RT-Zellablösungslösung auf die Platte und legen Sie sie für 3 min in einen 37 °C Inkubator. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen von der Platte gelöst sind. Fügen Sie 8 ml NBMc-Medien hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren. Abseihen durch ein einzelliges Sieb (70 μm).HINWEIS: Einzelzell-Dehnung ist optional, wenn mit adhärenter Kultur gearbeitet wird. 5 min bei 120 x g drehen. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie die verbleibenden Zellen in ~ 1 ml NBMc. Zählen Sie die Zellen (unter Verwendung der Zellimpermeant Färbung) und fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus GBM-Organoidkultur.Die Organoide werden mit einer geschnittenen p1000-Pipettenspitze auf eine 10 cm lange Kulturplatte überführt und so viel Restmedium wie möglich vorsichtig entfernt. Mit zwei sterilen Rasierern Organoide vorsichtig fein zerkleinern. Bewegen Sie die gehackten Organoide mit der geschnittenen p1000-Spitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ~ 2-3 ml NBMc-Medien hinzu. Bei 120 x g für 3 min drehen und den Überstand entfernen (für diesen Teil wird empfohlen, eine Pipettenspitze anstelle einer Vakuumabsaugung zu verwenden). Fügen Sie 2 ml Kaltzellenablösungslösung für 10 min hinzu.HINWEIS: Zellablösungslösung sollte direkt ab 4 °C verwendet und nicht zuerst erwärmt werden. Dies scheint das verbleibende Matrigel zu erweichen und hilft bei der Zellwiederherstellung. Dann für 10-20 min in einen 37 °C Inkubator gehen und alle paar Minuten beobachten und mischen. Wenn eine Verklumpung auftritt, die auf eine Zelllyse hinweisen kann, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Fügen Sie 8 ml NBMc-Medien hinzu, um die Zellablösungslösung zu verdünnen. Durch ein einzelliges Sieb (70 μm) abseihen und 5 min bei 120 x g schleudern. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie die verbleibenden Zellen in ~ 1 ml NBMc. Zählen Sie die Zellen (unter Verwendung der Zellimpermeant Färbung) und fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Herstellung von Organoiden aus einer einzelligen SuspensionLegen Sie das lrECM und ein kleines Zentrifugenröhrchen in einen Eiskübel oder kalten Block. Geben Sie die entsprechende Menge lrECM (16 μL x X Anzahl der vorgesehenen Organoide) in das kleine Zentrifugenröhrchen. Erstellen Sie eine Mischung von Zellen in einem Gesamtvolumen (4 μL x X Anzahl der beabsichtigten Organoide), die 20.000 Zellen / Organoid enthält, und fügen Sie dies dem kleinen Zentrifugenröhrchen mit lrECM auf Eis hinzu. 20 μL der lrECM/Zellsuspensionsmischung werden vorsichtig auf Parafilmformen pipettiert; Dadurch entsteht ein perlenartiges Tröpfchen.Achten Sie darauf, die lrECM / Zellsuspensionsmischung gründlich zu mischen, da die Zellen dazu neigen, sich leicht innerhalb der lrECM anzusiedeln, was zu heterogenen Organoiden führt. Bewahren Sie die lrECM/Zellsuspensionsmischung auf Eis auf. Wenn sich lrECM erwärmt, kann es polymerisieren und die Organoidbildung beeinträchtigen. Achten Sie darauf, die Pipettenspitze alle zwei bis drei Organoide zu kühlen, um eine lrECM-Polymerisation zu verhindern. Führen Sie keine Luftblasen in Organoide ein (vermeiden Sie ein “doppeltes Drücken” der Pipettenspitze). Sobald die gewünschte Anzahl von Organoiden in einer 10-cm-Kulturplatte auf Parafilmform pipettiert wurde, inkubieren Sie bei 37 °C für 1-2 h in einem Zellkulturinkubator. Nachdem sich die Organoide verfestigt haben, spülen Sie sie mit NBMc-Medien vorsichtig von der Parafilmform in eine neue, sterile 10 cm Kulturplatte mit insgesamt 20 ml NBMc. Die Verwendung einer p1000-Spitze funktioniert am besten, um Organoide von der Form zu spülen. Sie werden sanft abrutschen.HINWEIS: Etwa 15-20 Organoide pro 10 cm Kulturschale werden empfohlen. Stellen Sie die 10 cm große Kulturschale für 4 Tage in einen Inkubator (ohne zu schütteln). Nach 4 Tagen die Medien austauschen und auf einen Orbitalshaker bei 80 RPM im Zellkulturinkubator legen. Tauschen Sie danach alle 2-3 Tage Medien aus.Der Austausch von Medien mit unreifen Organoiden ist eine Herausforderung, da sie schwer zu visualisieren sind. Kippen Sie die Zellkulturschale und warten Sie mindestens 20 s; Die Organoide setzen sich unten ab und ermöglichen es, das Medium von oben mit einer großen Öffnungsglaspipette langsam zu entfernen. Achten Sie sorgfältig auf die Sammlung von Organoiden am Boden; Wenn sie durch die Kraft der Medienentfernung aufgewühlt erscheinen, halten Sie inne und lassen Sie sie sich wieder niederlassen. Wenn Organoide reifen und leichter zu visualisieren sind, wird dieser Prozess weniger nuanciert.HINWEIS: Manchmal kann das Platzieren eines Stücks dunklem Papier unter der Zellkulturplatte helfen, unreife Organoide zu visualisieren. Verwenden Sie keine Pasteur-Pipette mit Vakuumabsaugung, um Medien zu entfernen, da die Organoide auf diese Weise sehr leicht angesaugt und verloren gehen können. Wenn Organoide zum ersten Mal etabliert werden, verbrauchen sie Medien nicht so schnell wie reife Organoide. Beginnen Sie mit 50% Medienaustausch, um unnötige Mediennutzung zu reduzieren und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass versehentlich neue Organoide während des Medienaustauschprozesses beschädigt oder angesaugt werden. 5. Kryoembedding Legen Sie jedes Organoid in ein einzelnes 1,5-ml-Röhrchen (mit geschnittener p1000-Spitze), das 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) enthält. Organoide über Nacht bei 4 °C lagern. Wenn Sie Organoide in Paraffin einbetten, fahren Sie mit Abschnitt 6 fort. Nach der Fixierung über Nacht in 4% PFA die Organoide dreimal in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Das Organoid wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen (unter Verwendung der geschnittenen p1000-Pipettenspitze) überführt, das 1 ml 30% Saccharose enthält, und über Nacht bei 4 °C lagern. Fügen Sie eine kleine Menge (typischerweise 1-2 ml) der optimalen Schneidtemperaturverbindung (OCT) zu einer Kryoform hinzu, bedecken Sie den Boden und füllen Sie etwa 1/3 bis 1/2 der Tiefe der Form. Übertragen Sie ein einzelnes Organoid auf Kryomold mit geschnittener p1000-Pipettenspitze. Dies führt dazu, dass einige Medien mit dem Organoid übertragen werden, was unvermeidlich ist. Verwenden Sie eine kleinere Pipettenspitze, um das umgebende Medium vorsichtig zu entfernen, ohne das Organoid zu stören.HINWEIS: Dies kann schwierig zu visualisieren sein, aber langsames Pipettieren zeigt einen deutlichen Unterschied in der Dichte zwischen Medien und OCT, so dass dies bis zu einem gewissen Grad “nach Gefühl” geschieht). Legen Sie das Kryomold auf ein Tablett mit Trockeneis. OCT beginnt einzufrieren und wird dabei undurchsichtig. Fügen Sie zusätzliche OCT hinzu, um das Organoid vollständig zu bedecken und den Rest des Volumens der Kryoform auszufüllen. Blöcke können bei -20 °C für die kurzfristige Lagerung für mehrere Tage oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung auf unbestimmte Zeit gelagert werden. 6. Paraffin-Einbettung Sortieren Sie Organoide nach Größe (kleine Organoide sind unter 3 mm, große Organoide sind über 3 mm). Jedes Organoid wird mit einer geschnittenen p1000-Pipettenspitze in eine Histologiekassette überführt und gemäß Tabelle 2 oder Tabelle 3 zu Paraffinwachs verarbeitet.HINWEIS: Die Größe/Konfiguration der Histologiekassette ist dem Benutzer überlassen. Übertragen Sie Organoide aus den Kassetten in Einbettungsformen mit 1-2 mL geschmolzenem Paraffinwachs und kühlen Sie es, bis das Wachs halbfest ist. Sobald das Wachs teilweise verfestigt ist, fügen Sie mehr Wachs auf die Oberseite der Form hinzu. Legen Sie die beschriftete Kassettenplatte über die Form und geben Sie diese auf eine kalte Platte. Kühlen Sie weiter, bis das Wachs vollständig fest ist. Wenn das Wachs erstarrt ist, schneiden Sie den Block mit einem Mikrotom. Alternativ bei RT oder 4 °C zum späteren Schneiden lagern. 7. Immunfluoreszenz (IF) Deparaffinisieren und rehydrieren Sie 5-12 μm Paraffin-eingebettete Gewebeschnitte mit einer Objektträger-Färbeschale gemäß den folgenden Schritten.HINWEIS: Wenn Sie Schnitte aus OCT-eingebetteten Organoiden verwenden, empfehlen wir die Verwendung von 12-μm-Abschnitten. Entfernen Sie das OCT, indem Sie den Objektträger in PBS 30 Minuten lang schütteln. Fahren Sie mit Schritt 7.2 fort.5 min in Xylol inkubieren. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Dann 10 min in 100% Ethanol inkubieren. Wiederholen Sie dies noch einmal. Inkubieren Sie für 10 min in 95% Ethanol. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Waschen Sie die Abschnitte zweimal 5 Minuten in destilliertem Wasser. Zur Antigen-Demaskierung tauchen Sie Objektträger in 1x Citrat-Demaskierungslösung (Table of Materials) und Mikrowelle bei Untersiedetemperatur für 10 min. Achten Sie darauf, die Lösung nicht kochen zu lassen.HINWEIS: Dies wird am besten erreicht, wenn Sie zunächst ~ 2 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen, bis das Kochen auftritt, dann die Leistung senken und beobachten, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht überkocht. Die bevorzugte Demaskierungstemperatur liegt knapp unter 100 °C, idealerweise 98 °C. Lassen Sie die Objektträger 30 min bei RT in der 1x Citrat-Demaskierungslösung abkühlen.HINWEIS: Dies ist die gleiche 1x Citratlösung; Die Lösung muss in diesem Schritt nicht ersetzt werden. Waschen Sie die Objektträger zweimal 5 Minuten lang in destilliertem Wasser. Die Objektträger in 1x TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20) Puffer für 5 min waschen. Entfernen Sie die Objektträger von TBST und trocknen Sie sie vorsichtig um Gewebeabschnitte mit einem Laborreinigungstuch, wobei Sie darauf achten, den Gewebeabschnitt nicht trocknen zu lassen. Sobald der Objektträger ausreichend trocken ist, umkreisen Sie Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Barrierestift. Blockieren Sie jeden Abschnitt mit 100-400 μL 10% Serumblocklösung für 1 h bei RT. Wählen Sie die Serumblockerlösung basierend auf dem sekundären Antikörper. Wenn Sie beispielsweise einen sekundären Antikörper aus Esel verwenden, verwenden Sie ein 10% normales Eselserum in 1x TBST. Entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie dann 100-400 μL primären Antikörper auf die gewünschte Konzentration verdünnt in die Blockierlösung ein. Bei 4 °C die Abschnitte über Nacht mit dem primären Antikörper inkubieren. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x TBST für 5 min. Fügen Sie 100-400 μL sekundären Antikörper (1:1000 Verdünnung in Blocklösung oder gemäß den Anweisungen des Herstellers) zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie für 1,5 h bei RT. Waschen Sie die Objektträger zweimal in 1x TBST für 5 min. Anschließend die Dias in 1x PBS für 5 min waschen. Entfernen Sie die Objektträger von PBS und trocknen Sie sie mit einem Laborreinigungstuch um Gewebeabschnitte herum. Fügen Sie ein paar Tropfen flüssiges Härtungsmittel hinzu und montieren Sie vorsichtig ein Glasdeckglas. Sobald die Objektträger trocken sind, bei -20 °C lichtgeschützt lagern, bis sie für die Bildgebung bereit sind. 8. Immunhistochemie Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitte mit einer Objektträger-Färbeschale gemäß den folgenden Schritten.HINWEIS: Wenn Sie Abschnitte aus OCT-eingebetteten Organoiden verwenden, entfernen Sie OCT, indem Sie den Objektträger 30 Minuten lang in PBS schütteln. Fahren Sie mit Schritt 8.2 fort.5 min in Xylol inkubieren. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Inkubieren Sie für 10 min in 100% Ethanol. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Inkubieren Sie für 10 min in 95% Ethanol. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Abschnitte zweimal 5 min in destilliertem Wasser waschen. Zur Antigen-Demaskierung Objektträger in 1x Citrat-Demaskierungslösung und Mikrowelle bei Untersiedetemperatur für 10 min tauchen. Achten Sie darauf, die Lösung nicht kochen zu lassen. In der 1x Citrat-Demaskierungslösung die Dias 30 min bei RT abkühlen lassen. Waschen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten in destilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Objektträger für 10 min in 3% Wasserstoffperoxid. Die Objektträger zweimal 5 min in destilliertem Wasser waschen. Die Objektträger 5 min in 1x TBST waschen. Entfernen Sie die Objektträger von 1x TBST und trocknen Sie dann vorsichtig in der Ecke eines Laborreinigungstuchs um Gewebeabschnitte herum. Kreisen Sie die Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barrierestift, sobald der Objektträger trocken ist. 100-400 μL der Blockierlösung auf jeden Abschnitt innerhalb des hydrophoben Barrierestiftkreises bei RT für 1 h geben. Verwenden Sie entweder 10% normales Eselserum (NDS) oder 0,75% Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt in 1x TBST. Als nächstes entfernen Sie die Blockierlösung und fügen 100-400 μL des primären Antikörpers zu jedem Abschnitt hinzu. Verdünnen Sie diesen primären Antikörper mit dem entsprechenden Verdünnungsmittel des Herstellers auf die gewünschte Konzentration. Die Abschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x TBST für 5 min. Fügen Sie 100-400 μL IHC-Detektionsreagenz zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei RT. Wählen Sie das IHC-Nachweisreagenz entsprechend dem primären Antikörper. Waschen Sie jeden Abschnitt zweimal mit 1x TBST für 5 min, gefolgt von 1x PBS für 5 min einmal. Bereiten Sie 3,3-Diaminobenzidin (DAB) -Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Fügen Sie 100-400 μL DAB-Lösung zu jedem Gewebeabschnitt hinzu und überwachen Sie genau unter einem Mikroskop. Zwischen 1-10 min sorgt für eine akzeptable Färbeintensität; Achten Sie darauf, diese Zeit zu notieren und für alle Gewebeabschnitte konsistent zu bleiben. Nachdem die gewünschte Färbeintensität erreicht ist, tauchen Sie die Objektträger in destilliertes Wasser. Führen Sie eine Hämatoxylin-Gegenfärbung und Objektträgerdehydratisierung zur Montage gemäß den Anweisungen in Tabelle 4 durch. Entfernen Sie den Objektträger vom Xylolersatz (Table of Materials) und wischen Sie mit einem Laborreinigungstuch zusätzliche Flüssigkeit um den Gewebeabschnitt herum ab. Verwenden Sie eine kleine Menge permanentes Montagemedium, um das Deckglas über dem Gewebeabschnitt zu montieren und trocknen zu lassen. 9. Messung der Lebensfähigkeit der Gesamtzelle Übertragen Sie jedes Organoid in ein 2-ml-Röhrchen und entfernen Sie vorsichtig mit einer kleinen Pipettenspitze alle überschüssigen Medien um das Organoid herum (siehe Abbildung 3 für das Schema dieses Verfahrens).HINWEIS: Zelllebensfähigkeitstests müssen mit Organoiden durchgeführt werden, die mit identischer Anzahl von Zellen hergestellt wurden. Dieses Experiment sollte nicht an Organoiden durchgeführt werden, die direkt aus Patientenproben aus der Chirurgie, aus dem Schneiden von alredy gebildeten Organoiden oder anderen Fällen hergestellt wurden, in denen einzelne Zellen nicht gefiltert und gezählt wurden. Bereiten Sie das Lumineszenzzelllebensfähigkeits-Assay-Reagenz und 1x PBS im Verhältnis 1:1 vor und fügen Sie jedem Röhrchen 500 μL hinzu. Verwenden Sie eine p1000-Pipettenspitze, um aggressiv auf und ab zu pipettieren, um das Organoid abzubauen, und lassen Sie es 5 Minuten lang ruhen. Das Organoid sollte inzwischen etwas dissoziiert und weicher sein; Wiederholen Sie das Mischen mit der P1000-Pipettenspitze erneut. Ziel ist es, 100 μL Gesamtvolumen pro Vertiefung einer 96-Well-Platte zu haben. Fügen Sie 25 μL der Mischung aus Schritt 9.3 hinzu (reicht für mehrere technische Replikate) und fügen Sie 75 μL des verbleibenden lumineszierenden Zelllebensfähigkeitstests und PBS-Gemisches hinzu. Legen Sie die Platte für 2 min auf einen Shaker und inkubieren Sie sie dann für 20 min bei RT. Lesen Sie die Platte mit einer Lumineszenzeinstellung auf einem Plattenlesegerät, und erfassen Sie die Daten (siehe Abbildung 4).