三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持

以下に詳述するプロトコルのすべてのステップは、クリーブランドクリニック治験審査委員会(IRB)プロトコル#2559および機関バイオセーフティ委員会(IBC)承認#1711に従って開発および実施されました。スフィアとオルガノイドは「ニューロバサルメディアコンプリート」(NBMc)で培養されます。手順については 、表 1 を参照してください。 1. オルガノイド型を作る パラフィルムシート(約4 cm x 4 cmのサイズ)からパラフィン紙を取り出し、2つの滅菌96ウェルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートの間に置きます。培養フードでこれらの手順を実行し、パラフィルムの「内側」(紙で覆われている側)を清潔に保つように特に注意してください。このきれいな面は、くぼみの凹みを作るはずです。 上部の96ウェルPCRプレートに均等な圧力を加えて、パラフィルムに小さなディンプルを形成します。目標は、パラフィルムに穴を開けずにディンプルの深さを約2mmにすることです。 2 つの 96 ウェル PCR プレートを穏やかに分離します。くぼみのあるパラフィルムは天板にくっつきます。これをドライアイスの上に約30秒間置きます。 パラフィルムをドライアイス上で30秒間置いた後、滅菌鉗子を使用してパラフィルムを上部の96ウェルPCRプレートから引き抜きます。パラフィルムを取り外すときは、非常に「注意」するのではなく、素早い動きを使用してください。凍結したパラフィルムは、温めたパラフィルムよりも簡単に取り除くことができ、ディンプルが反転する可能性があります。 完成したパラフィルム型を、蓋をした滅菌済みの10 cm細胞培養皿に入れます。金型は事前に作成して、無菌性が維持されていれば保管できます。 2.患者組織標本の肉眼解剖 滅菌培養皿(10 cm細胞培養プレート)で、2つの滅菌カミソリブレードを使用して、圧力をかけながら患者検体を細かく刻みます。注:検体のミンチは、培養皿に約500 μLのNBMcがあると最も簡単です。かみそりの刃で、できるだけ細かく刻んでみてください。理想的には、個々のピースは1 mm3 以下です。 細かく刻んだ腫瘍片を、カットしたp1000ピペットチップを使用して15 mL遠心チューブに移します。注:オルガノイドを取り扱うときは、カットp1000ピペットチップのみを使用することが重要です。これらは、鋭利なかみそりを使用して希望の開口部サイズ(約5〜8 mm)にカットし、オートクレーブ滅菌することができます。 室温(RT)細胞剥離溶液2 mL(材料表)を加え、37°C、5%CO2 インキュベーターに約10分間入れます。注意: 数分ごとに観察して混ぜてください。一部の細胞剥離溶液または標本では、さまざまなインキュベーション時間が必要になる場合があります。細胞溶解によるDNA放出を示す凝集が現れた場合は、すぐに次のステップに進みます。 8 mLのNBMc培地を加えて細胞剥離溶液を中和し、65 x gで3分間スピンします。 上清を吸引し、組織を1〜2 mLのNBMcに再懸濁します。 3. 患者一次組織からのオルガノイドの生成 注:患者の一次組織からオルガノイドを作製する際の目標は、三次元培養を確立することです。単一セルをフィルタリングしたり、セルをカウントしたりするのではなく、目視検査を使用して初期セル負荷をできるだけ均一に保ちます。初期オルガノイドの成長と確立に不均一性があるのは正常です。各オルガノイドの容量は20 μLになります(ステップ2.5から、16 μLのラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)と4 μLの組織をNBMcに懸濁)。指示は、意図するオルガノイドの数に合わせて調整できます。目標は、通常、一次患者検体から約20〜30個のオルガノイドを形成することです。 アイスバケットまたはコールドブロックに、lrECMと小さな遠心チューブを置きます。適量のlrECM(16 μL x X 目的のオルガノイド数)を小型遠沈管に入れます。 ステップ2.5の適切な量の組織懸濁液(4 μL x 目的のオルガノイドの数)を氷上の遠沈管に追加します。 20 μLのlrECM/細胞懸濁液をパラフィルム型に慎重にピペットで移します。これにより、真珠のような液滴が形成されます。必ずlrECM /細胞懸濁液の混合物を完全に混合してください。細胞はlrECM内に容易に定着する傾向があり、その結果、不均一なオルガノイドが得られます。 lrECM /細胞懸濁液を氷上に保ちます。lrECMが温まると、重合してオルガノイド形成を損なう可能性があります。lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。オルガノイドに気泡を入れないでください(ピペットを「二重に押す」ことは避けてください)。 所望の数のオルガノイドを10cm細胞培養プレート中のパラフィルム型上にピペットで移したら、プレート蓋で覆い、細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2 中で1〜2時間インキュベートする。 オルガノイドが固まったら、NBMc培地を使用してパラフィルムモールドから静かに洗い流し、合計20 mLのNBMcを含む新しい滅菌10 cm培養プレートに入れます。p1000チップを使用すると、オルガノイドを型から洗い流すのに最適です。彼らは穏やかに滑り落ちます。注:オルガノイドを型から細胞培養プレートに流すと、培地中に小さなピンク色の球体として見えるはずです。オルガノイドがメディアでバラバラになったり粉々になったりしたように見える場合、これはlrECMが重合したという以前の問題を示しており、オルガノイドはまだ成長する可能性がありますが、サイズが均一である可能性はほとんどありません。 この10cm培養皿を37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ、5%CO2 (振とうせずに)4日間行った。注:最初の数日間にオービタルシェーカーにオルガノイドを配置すると、オルガノイドがバラバラになる可能性があります。4日目まで揺れていないことを確認してください。 4日後、培地を交換し、37°C、5%CO2の細胞培養インキュベーター内で80RPMのオービタルシェーカーに入れます。未成熟なオルガノイドとの培地交換は、可視化が難しいため困難です。細胞培養皿を傾け、少なくとも20秒間待ちます。オルガノイドは底部に沈殿し、ガラスまたはプラスチックの10〜20 mLピペットで上から培地をゆっくりと除去することができます。 下部のオルガノイドの収集に細心の注意を払ってください。彼らがメディア除去の力で動揺しているように見える場合は、一時停止して再定住させるのが最善です。オルガノイドが成熟し、視覚化しやすくなるにつれて、このプロセスは微妙な違いが少なくなります。注:細胞培養プレートの下に暗い紙を置くと、未熟なオルガノイドを視覚化するのに役立つ場合があります。真空吸引付きのパスツールピペットは、オルガノイドが吸い上げられて失われやすいため、培地を除去するために使用しないことをお勧めします。 オルガノイドが最初に確立されたとき、それらは成熟したオルガノイドほど速く培地を消費しません。50%の培地交換から始めることで、不要な培地の使用を減らし、培地交換プロセス中に新しいオルガノイドを誤って損傷または吸引する可能性を減らします。 4.確立されたGBM球、接着性、またはオルガノイド培養からのオルガノイドの生成 注:ここでの目標は、比較実験で使用するためにサイズと細胞量が均一なオルガノイドを作成することであるため、単一細胞フィルターを使用して細胞をカウントし、これを確実にします。 GBMスフェア培養液からの単一細胞懸濁液を調製する。注:GBM細胞のスフェア培養はNBMc培地で維持されます。球体を15 mLの遠沈管に入れ、120 x g で5分間回転させます。 上清を除去し、2 mLのRT細胞剥離溶液を加えます。37°Cのインキュベーターに3分間入れます。 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離溶液を中和します。シングルセルストレーナー(70 μm)でひずみ、120 x gで5分間回転させます。 チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過染色を使用)、手順4.4に進みます。 GBM付着培養物からシングルセル懸濁液を調製する。使用済みの培地をプレートから取り出し、2 mLのRT細胞剥離溶液をプレートに加え、37°Cのインキュベーターに3分間入れます。 細胞がプレートから剥離していることを顕微鏡で確認します。 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離液を中和します。シングルセルストレーナー(70 μm)でひずみます。注:接着培養を使用する場合、単一細胞のひずみはオプションです。 120 x gで5分間回転します。チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過染色を使用)、手順4.4に進みます。 GBMオルガノイド培養からの単一細胞懸濁液を調製する。カットしたp1000ピペットチップを使用してオルガノイドを10 cm培養プレートに移し、できるだけ多くの残留培地を慎重に除去します。 2つの滅菌カミソリを使用して、オルガノイドを細かく細かく刻みます。カットしたp1000チップで、ミンチオルガノイドを15 mLの遠沈管に移し、~2-3 mLのNBMc培地を加えます。 120 x g で3分間回転し、上清を取り除きます(この部分には真空吸引ではなくピペットチップを使用することをお勧めします)。 2 mLのコールドセル剥離溶液を10分間加えます。注:細胞剥離溶液は、最初に加温するのではなく、4°Cから直接使用する必要があります。これは、残っているマトリゲルを柔らかくし、細胞の回復を助けるようです。 その後、37°Cのインキュベーターに10〜20分間移動し、数分ごとに観察および混合します。細胞溶解を示す可能性のある凝集が現れた場合は、すぐに次のステップに進みます。 8 mLのNBMc培地を加えて、細胞剥離液を希釈します。シングルセルストレーナー(70 μm)で濾し、120 x gで5分間回転させます。 チューブから上清を取り除き、残りの細胞を~1 mLのNBMcに再懸濁します。 細胞をカウントし(細胞不透過性染色を使用して)、ステップ4.4に進みます。 単一細胞懸濁液からのオルガノイド作製アイスバケットまたはコールドブロックに、lrECMと小さな遠心チューブを置きます。適量のlrECM(16 μL x X 目的のオルガノイド数)を小型遠沈管に入れます。 20,000個の細胞/オルガノイドを含む総容量(4 μL x X個の目的のオルガノイド)の細胞の混合物を作成し、これを氷上でlrECMを使用して小型遠心チューブに追加します。 20 μLのlrECM/細胞懸濁液をパラフィルム型に慎重にピペットで移します。これにより、真珠のような液滴が形成されます。細胞はlrECM内に容易に沈降する傾向があり、これにより不均一なオルガノイドが生じるため、lrECM/細胞懸濁液混合物を完全に混合するようにしてください。 lrECM /細胞懸濁液を氷上に保ちます。lrECMが温まると、重合してオルガノイド形成を損なう可能性があります。 lrECM重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。オルガノイドに気泡を入れないでください(ピペットチップを「ダブルプッシュ」しないでください)。 所望の数のオルガノイドを10cm培養プレート内のパラフィルム型上にピペットで移したら、細胞培養インキュベーター内で37°Cで1〜2時間インキュベートする。 オルガノイドが固まったら、NBMc培地を使用してパラフィルムモールドから静かに洗い流し、合計20 mLのNBMcを含む新しい滅菌10 cm培養プレートに入れます。p1000チップを使用すると、オルガノイドを型から洗い流すのに最適です。彼らは穏やかに滑り落ちます。注:10 cmの培養皿あたり約15〜20個のオルガノイドが推奨されます。 10 cmの培養皿をインキュベーターに(振とうせずに)4日間入れます。 4日後、培地を交換し、細胞培養インキュベーター内の80 RPMのオービタルシェーカーに置きます。その後、2〜3日ごとにメディアを交換します。未成熟なオルガノイドとの培地交換は、可視化が難しいため困難です。細胞培養皿を傾け、少なくとも20秒間待ちます。オルガノイドは底部に落ち着き、大きな開口部のガラスピペットで上から培地をゆっくりと取り除くことができます。 下部のオルガノイドの収集に細心の注意を払ってください。彼らがメディア除去の力で動揺しているように見える場合は、一時停止して、彼らが再定住するのを待ちます。オルガノイドが成熟し、視覚化しやすくなるにつれて、このプロセスは微妙な違いが少なくなります。注:細胞培養プレートの下に暗い紙を置くと、未熟なオルガノイドを視覚化するのに役立つ場合があります。真空吸引付きのパスツールピペットを使用してメディアを除去すると、オルガノイドが吸い上げられて失われやすくなります。 オルガノイドが最初に確立されたとき、それらは成熟したオルガノイドほど速く培地を消費しません。50%の培地交換から始めて、不要な培地の使用を減らし、培地交換プロセス中に新しいオルガノイドを誤って損傷または吸引する可能性を減らします。 5. クライオム埋め込み 各オルガノイドを、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む個々の1.5 mLチューブ(カットp1000チップを使用)に入れます。オルガノイドを4°Cで一晩保存します。 オルガノイドをパラフィンに埋め込む場合は、セクション6に進みます。 4%PFAで一晩固定した後、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でオルガノイドを3回洗浄します。 オルガノイドを、1 mLの30%スクロースを水に含む新しい1.5 mLチューブ(カットp1000ピペットチップを使用)に移し、4°Cで一晩保存します。 少量(通常は1〜2 mL)の最適な切断温度コンパウンド(OCT)をクライオモールドに追加し、底部を覆い、金型の深さの約1/3〜1/2を満たします。 カットp1000ピペットチップを使用して、単一のオルガノイドをクライオモールドに移します。これにより、一部の培地がオルガノイドとともに転写されますが、これは避けられません。小さいピペットチップを使用して、オルガノイドを乱すことなく周囲の培地を慎重に除去します。注:これは視覚化するのが難しい場合がありますが、遅いピペッティングではメディアとOCTの密度に明確な違いが見られるため、これはある程度「感触によって」行われます)。 クライオモルドをドライアイスのトレイに置きます。OCTはフリーズを開始し、その過程で不透明になります。 OCTを追加してオルガノイドを完全に覆い、残りの体積のクライオモールドを満たします。ブロックは、数日間の短期保管の場合は-20°Cで、無期限の長期保存の場合は-80°Cで保存できます。 6.パラフィン包埋 オルガノイドをサイズで並べ替えます(小さなオルガノイドは3 mm未満、大きなオルガノイドは3 mm以上)。カットしたp1000ピペットチップを使用して各オルガノイドを組織学的カセットに移し、表 2 または 表3に従ってパラフィンワックスに加工する。注:組織学カセットのサイズ/構成はユーザー次第です。 オルガノイドをカセットから埋め込み型に移し、1〜2 mLの溶かしたパラフィンワックスを入れ、ワックスが半固体になるまで冷やします。 ワックスが部分的に固まったら、金型の上部にワックスを追加します。ラベルの付いたカセットトップを金型の上に置き、これをコールドプレートに移します。ワックスが完全に固まるまで冷却を続けます。 ワックスが固まったら、ミクロトームを使用してブロックを切断します。または、後で切片化するためにRTまたは4°Cで保存してください。 7.免疫蛍光法(IF) 以下の手順に従って、スライド染色皿を用いて5〜12μmパラフィン包埋組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。注:OCT包埋オルガノイドの切片を使用する場合は、12 μm切片の使用をお勧めします。スライドをPBSで30分間振ってOCTを取り外します。手順 7.2 に進みます。キシレン中で5分間インキュベートします。これをさらに2回繰り返します。その後、100%エタノール中で10分間インキュベートします。これをもう一度繰り返します。 95%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。切片を蒸留水で5分間、2回洗浄します。 抗原のマスク解除には、スライドを1xクエン酸塩アンマスキング溶液(材料表)に沈め、沸点以下の温度で10分間電子レンジで加熱します。溶液を沸騰させないように注意してください。注意: これは、沸騰が発生するまで最初に~2分間電子レンジで加熱し、次に電力を下げて、溶液が沸騰しないように監視する場合に最もよく達成されます。好ましいマスキング解除温度は100°Cをわずかに下回り、理想的には98°Cです。 スライドを30xクエン酸塩マスキング解除溶液のRTで1分間冷却します。注:これは同じ1xクエン酸塩溶液です。このステップでソリューションを交換する必要はありません。 スライドを蒸留水で5分間、2回洗います。 スライドを1x TBST(0.1%トゥイーン20を含むトリス緩衝生理食塩水)バッファーで5分間洗浄します。 TBSTからスライドを取り出し、組織切片を乾燥させないように注意しながら、実験室のクリーニングワイプを使用して組織切片の周りを注意深く乾かします。スライドが十分に乾いたら、疎水性バリアペンで組織切片を一周します。 各切片を100〜400 μLの10%血清ブロッキング溶液でRTで1時間ブロックします。 二次抗体に基づいて血清ブロッキング溶液を選択します。たとえば、ロバで作られた二次抗体を使用する場合は、1x TBSTで10%の正常ロバ血清を使用します。 ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液に所望の濃度に希釈した100〜400μLの一次抗体を加える。 4°Cで、切片を一次抗体と共に一晩インキュベートします。 一次抗体溶液を取り出し、スライドを1x TBSTで5分間、3回洗浄します。 100〜400 μLの二次抗体(ブロッキング溶液で1:1000希釈、または製造元の指示に従って)を各セクションに加え、RTで1.5時間インキュベートします。 スライドをTBST1回で5分間、2回洗浄します。次に、スライドを1x PBSで5分間洗浄します。 PBSからスライドを取り出し、実験室のクリーニングワイプを使用して組織切片の周りを乾燥させます。液体硬化封入剤を数滴加え、ガラスカバーガラスを慎重に取り付けます。スライドが乾いたら、イメージングの準備ができるまで、光から保護された-20°Cで保管します。 8. 免疫組織化学 以下の手順に従って、スライド染色皿を用いてパラフィン包埋組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。注:OCT包埋オルガノイドの切片を使用する場合は、スライドをPBSで30分間振ってOCTを除去します。手順 8.2 に進みます。キシレン中で5分間インキュベートします。さらに2回繰り返します。 100%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。 95%エタノール中で10分間インキュベートします。もう一度繰り返します。 セクションを蒸留水で5分間、2回洗浄します。 抗原アンマスキングの場合は、スライドを1xクエン酸塩アンマスキング溶液に沈め、マイクロ波でサブボリング温度で10分間加熱します。溶液を沸騰させないように注意してください。 1xクエン酸塩マスキング解除溶液のRTで30分間スライドを冷まします。 スライドを蒸留水で5分間3回洗います。 スライドを3%過酸化水素中で10分間インキュベートします。 スライドを蒸留水で5分間2回洗います。 スライドを1x TBSTで5分間洗浄します。 1x TBSTからスライドを取り外し、実験室のクリーニングワイプの角を使用して、組織切片の周りを注意深く乾かします。 スライドが乾いたら、疎水性バリアペンで組織切片を一周します。 100〜400 μLのブロッキング溶液を、疎水性バリアペンサークル内の各セクションにRTで1時間置きます。10%正常ロバ血清(NDS)または0.75%ウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかを1x TBSTで希釈して使用します。 次に、ブロッキング溶液を除去し、各切片に100〜400μLの一次抗体を追加します。この一次抗体を適切なメーカーの希釈液を使用して所望の濃度に希釈します。 切片を4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体溶液を取り出し、スライドを1x TBSTで5分間、3回洗浄します。 各切片に100〜400 μLのIHC検出試薬を加え、RTで1時間インキュベートします。 一次抗体に応じてIHC検出試薬を選択してください。 各セクションを1x TBSTで5分間、2回洗浄し、続いて1x PBSで5分間1回洗浄します。 製造元の指示に従って3,3-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製します。各組織切片に100〜400μLのDAB溶液を加え、顕微鏡下で綿密にモニターします。1〜10分で許容できる染色強度が得られます。この時間をメモし、すべての組織切片で一貫性を保ってください。 希望の染色強度に達したら、スライドを蒸留水に浸します。 表4の指示に従って、ヘマトキシリン対比染色とスライド脱水を行い、取り付けます。 キシレン代替品(材料表)からスライドを取り外し、実験室のクリーニングワイプを使用して組織セクションの周りの余分な液体を拭き取ります。少量の永久封入剤を使用して、ティッシュセクションにカバーガラスを取り付け、乾燥させます。 9.全細胞生存率の測定 各オルガノイドを2 mLチューブに移し、小さなピペットチップを使用して、オルガノイドの周囲の余分な培地をすべて慎重に取り除きます(この手順の概略図については 図3 を参照してください)。注:細胞生存率アッセイは、同じ数の細胞で作成されたオルガノイドを使用して実行する必要があります。この実験は、手術を受けた患者の検体から直接作られたオルガノイド、alredyで形成されたオルガノイドの切断、または単一細胞がろ過およびカウントされなかったその他の場合には実行しないでください。 発光細胞生存率アッセイ試薬と1x PBSを1:1の比率で調製し、各チューブに500 μLを加えます。 p1000ピペットチップを使用して積極的に上下にピペットし、オルガノイドを分解し、5分間放置します。オルガノイドはやや解離し、柔らかくなっているはずです。P1000ピペットチップとの混合をもう一度繰り返します。 目標は、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLの総容量を持つことです。ステップ9.3から25 μLの混合物を追加し(複数のテクニカルレプリケートに十分です)、残りの発光細胞生存率アッセイとPBS混合物75 μLを追加します。 プレートをシェーカーに2分間置き、RTで20分間インキュベートします。 プレートリーダーの発光設定を使用してプレートを読み取り、データを収集します ( 図4を参照)。