Заражение Caenorhabditis elegans микроспоридийным паразитом Nematocida parisii позволяет червям производить потомство, которое обладает высокой устойчивостью к одному и тому же патогену. Это пример унаследованного иммунитета, плохо изученного эпигенетического явления. Настоящий протокол описывает изучение унаследованного иммунитета в генетически податливой модели червя.
Наследственный иммунитет описывает, как некоторые животные могут передать «память» о предыдущей инфекции своему потомству. Это может повысить устойчивость патогенов в их потомстве и способствовать выживанию. В то время как наследственный иммунитет был зарегистрирован у многих беспозвоночных, механизмы, лежащие в основе этого эпигенетического явления, в значительной степени неизвестны. Заражение Caenorhabditis elegans естественным микроспоридиевым патогеном Nematocida parisii приводит к тому, что черви производят потомство, которое устойчиво устойчиво к микроспоридиям. Настоящий протокол описывает изучение межпоколенческого иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii –C. elegans . В настоящей статье описаны методы заражения C. elegans и получения иммуно-праймированного потомства. Также приведены методы анализа устойчивости к микроспоридиозной инфекции путем окрашивания на микроспоридию и визуализации инфекции с помощью микроскопии. В частности, унаследованный иммунитет предотвращает инвазию клеток-хозяев микроспоридиями, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может быть использована для количественной оценки событий инвазии. Относительное количество спор микроспоридии, продуцируемых в иммунно-праймированном потомстве, может быть количественно определено путем окрашивания спор хитин-связывающим красителем. На сегодняшний день эти методы пролили свет на кинетику и патогенную специфичность унаследованного иммунитета, а также на молекулярные механизмы, лежащие в его основе. Эти методы, наряду с обширными инструментами, доступными для исследований C. elegans , позволят сделать важные открытия в области унаследованного иммунитета.
Наследственный иммунитет является эпигенетическим явлением, при котором родительское воздействие патогенов может обеспечить производство устойчивого к инфекции потомства. Этот тип иммунной памяти был показан у многих беспозвоночных, у которых отсутствует адаптивная иммунная система и которые могут защитить от вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний1. В то время как унаследованный иммунитет имеет важные последствия для понимания как здоровья, так и эволюции, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой защиты, в значительной степени неизвестны. Отчасти это связано с тем, что многие животные, у которых был описан унаследованный иммунитет, не являются установленными модельными организмами для исследований. Напротив, исследования прозрачной нематоды Caenorhabditis elegans извлекают выгоду из обширного генетического и биохимического инструментария 2,3, высоко аннотированного генома 4,5 и короткого времени генерации. Действительно, исследования c. elegans позволили добиться фундаментальных успехов в области эпигенетики и врожденного иммунитета 6,7, и в настоящее время это установленная модель для изучения иммунной памяти 8,9.
Микроспоридия являются грибковыми патогенами, которые заражают почти всех животных и вызывают смертельные инфекции у людей с ослабленным иммунитетом10. Инфекция начинается, когда спора микроспоридии вводит или «запускает» свое клеточное содержимое (спороплазму) в клетку-хозяина, используя структуру, называемую полярной трубкой. Внутриклеточная репликация паразита приводит к образованию меронтов, которые в конечном итоге дифференцируются в зрелые споры, которые могут выходить из клетки11,12. Хотя эти паразиты наносят ущерб как здоровью человека, так и продовольственной безопасности, еще многое предстоит узнать об их биологии инфекции12. Nematocida parisii – это естественный микроспоридиальный паразит, который реплицируется исключительно в кишечных клетках червей, что приводит к снижению плодовитости и, в конечном счете, гибели. Модель инфекции N. parisii –C. elegans была использована, чтобы показать: (1) роль аутофагии в клиренсе патогена13, (2) как микроспоридия может выходить из инфицированных клеток нелитически14, (3) как патогены могут распространяться от клетки к клетке, образуя синцитию15, (4) белки, используемые N. parisii для взаимодействия со своим хозяином16, и (5) регуляцию транскрипционного внутриклеточного ответа патогена (IPR)17, 18.
Протоколы заражения C. elegans описаны в текущей работе и могут быть использованы для выявления уникальной биологии микроспоридии и препарирования реакции хозяина на инфекцию. Микроскопия неподвижных червей, окрашенных хитин-связывающим красителем Direct Yellow 96 (DY96), показывает распространение инфекции хитинсодержащими спорами микроспоридий по всему кишечнику. Окрашивание DY96 также позволяет визуализировать хитинсодержащие эмбрионы червей для одновременной оценки гравидности червя (способности производить эмбрионы) в качестве считывания пригодности хозяина.
Недавняя работа показала, что C. elegans , инфицированные N. parisii , производят потомство, которое устойчиво устойчиво к той же инфекции19. Этот унаследованный иммунитет длится одно поколение и зависит от дозы, так как потомство от более сильно инфицированных родителей более устойчиво к микроспоридиям. Интересно, что потомство N. parisii-primed также более устойчиво к бактериальному кишечному патогену Pseudomonas aeruginosa, хотя они не защищены от естественного патогена вируса Orsay19. Настоящая работа также показывает, что иммунно-праймированное потомство ограничивает инвазию клеток хозяина микроспоридиями. Метод также описывает сбор иммунно-праймированного потомства и то, как FISH может быть использован для обнаружения N. parisii RNA в клетках кишечника для анализа инвазии клеток хозяина и сжигания спор20.
Вместе эти протоколы обеспечивают прочную основу для изучения микроспоридии и наследственного иммунитета у C. elegans. Есть надежда, что будущая работа в этой модельной системе позволит сделать важные открытия в зарождающейся области унаследованного иммунитета. Эти методы также, вероятно, станут отправными точками для исследования наследственного иммунитета, вызванного микроспоридией, у других организмов-хозяев.
Настоящий протокол описывает изучение микроспоридии и наследственного иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii –C. elegans .
Подготовка спор представляет собой интенсивный протокол, который обычно дает достаточно спор в течени…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Винни Чжао и Инь Чэнь Вану за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант No 522691522691).
2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |