Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans
Summary
L’infection de Caenorhabditis elegans par le parasite microsporidien Nematocida parisii permet aux vers de produire une progéniture très résistante au même agent pathogène. C’est un exemple d’immunité héréditaire, un phénomène épigénétique mal compris. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité héréditaire dans un modèle de ver génétiquement traitable.
Abstract
L’immunité héréditaire décrit comment certains animaux peuvent transmettre la « mémoire » d’une infection antérieure à leur progéniture. Cela peut augmenter la résistance aux agents pathogènes dans leur progéniture et favoriser la survie. Bien que l’immunité héréditaire ait été rapportée chez de nombreux invertébrés, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène épigénétique sont largement inconnus. L’infection de Caenorhabditis elegans par l’agent pathogène microsporidien naturel Nematocida parisii entraîne la production d’une progéniture robuste aux microsporidies. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité intergénérationnelle dans le modèle d’infection simple et génétiquement traitable de N. parisii –C. elegans . L’article actuel décrit les méthodes permettant d’infecter C. elegans et de générer une progéniture immuno-amorcée. Des méthodes sont également données pour mesurer la résistance à l’infection par microsporidies en colorant les microsporidies et en visualisant l’infection par microscopie. En particulier, l’immunité héréditaire empêche l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies, et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) peut être utilisée pour quantifier les événements d’invasion. La quantité relative de spores de microsporidies produites dans la progéniture immuno-amorcée peut être quantifiée en colorant les spores avec un colorant liant la chitine. À ce jour, ces méthodes ont mis en lumière la cinétique et la spécificité pathogène de l’immunité héréditaire, ainsi que les mécanismes moléculaires qui la sous-tendent. Ces techniques, ainsi que les nombreux outils disponibles pour la recherche sur C. elegans , permettront d’importantes découvertes dans le domaine de l’immunité héréditaire.
Introduction
L’immunité héréditaire est un phénomène épigénétique par lequel l’exposition parentale à des agents pathogènes peut permettre la production d’une progéniture résistante aux infections. Ce type de mémoire immunitaire a été démontré chez de nombreux invertébrés qui manquent de système immunitaire adaptatif et peuvent protéger contre les maladies virales, bactériennes etfongiques 1. Bien que l’immunité héréditaire ait des implications importantes pour la compréhension de la santé et de l’évolution, les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette protection sont largement inconnus. Cela s’explique en partie par le fait que bon nombre des animaux chez lesquels l’immunité héréditaire a été décrite ne sont pas des organismes modèles établis pour la recherche. En revanche, les études sur le nématode transparent Caenorhabditis elegans bénéficient d’une vaste boîte à outils génétique et biochimique 2,3, d’un génome hautement annoté 4,5 et d’un court temps de génération. En effet, la recherche sur C. elegans a permis des avancées fondamentales dans les domaines de l’épigénétique et de l’immunité innée 6,7, et c’est maintenant un modèle établi pour l’étude de la mémoire immunitaire 8,9.
Les microsporidies sont des agents pathogènes fongiques qui infectent presque tous les animaux et provoquent des infections mortelles chez les humains immunodéprimés10. L’infection commence lorsqu’une spore de microsporidie injecte ou « déclenche » son contenu cellulaire (sporoplasme) dans une cellule hôte à l’aide d’une structure appelée tube polaire. La réplication intracellulaire du parasite entraîne la formation de méronts, qui se différencient finalement en spores matures qui peuvent sortir de la cellule11,12. Bien que ces parasites nuisent à la fois à la santé humaine et à la sécurité alimentaire, il reste encore beaucoup à apprendre sur la biologie de leur infection12. Nematocida parisii est un microsporidien naturel qui se réplique exclusivement dans les cellules intestinales des vers, entraînant une réduction de la fécondité et, finalement, la mort. Le modèle d’infection à N. parisii –C. elegans a été utilisé pour montrer : (1) le rôle de l’autophagie dans la clairance des agents pathogènes13, (2) comment les microsporidies peuvent sortir des cellules infectées de manière non lytique14, (3) comment les agents pathogènes peuvent se propager de cellule en cellule en formant une syncytie15, (4) les protéines que N. parisii utilise pour interagir avec son hôte16, et (5) la régulation de la réponse interne à l’agent pathogène transcriptionnel (DPI)17, 18.
Les protocoles pour l’infection de C. elegans sont décrits dans les travaux actuels et peuvent être utilisés pour révéler la biologie unique des microsporidies et disséquer la réponse de l’hôte à l’infection. La microscopie de vers fixes colorés avec le colorant liant la chitine Direct Yellow 96 (DY96) montre la propagation de l’infection des spores de microsporidies contenant de la chitine dans tout l’intestin. La coloration DY96 permet également la visualisation d’embryons de vers contenant de la chitine pour l’évaluation simultanée de la gravidité des vers (capacité à produire des embryons) en tant que lecture de l’aptitude de l’hôte.
Des travaux récents ont révélé que C. elegans infecté par N. parisii produit une progéniture robustement résistante à la même infection19. Cette immunité héréditaire dure une seule génération et dépend de la dose, car la progéniture de parents plus fortement infectés est plus résistante aux microsporidies. Fait intéressant, la progéniture amorcée par N. parisii est également plus résistante à l’agent pathogène intestinal bactérien Pseudomonas aeruginosa, bien qu’elle ne soit pas protégée contre l’agent pathogène naturel Orsay virus19. Les présents travaux montrent également que la progéniture immuno-amorcée limite l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies. La méthode décrit également la collection de descendants immuno-amorcés et comment FISH peut être utilisé pour détecter l’ARN de N. parisii dans les cellules intestinales afin de tester l’invasion des cellules hôtes et le déclenchement des spores20.
Ensemble, ces protocoles fournissent une base solide pour l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire chez C. elegans. On espère que les travaux futurs dans ce système modèle permettront d’importantes découvertes dans le domaine naissant de l’immunité héréditaire. Ces techniques sont également susceptibles d’être des points de départ pour étudier l’immunité héréditaire induite par les microsporidies chez d’autres organismes hôtes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à N. parisii-C. elegans simple et génétiquement traitable.
La préparation des spores est un protocole intensif qui produit généralement suffisamment de spores pour 6 mois d’expériences, en fonction de la productivité24. Il est important de noter que l’infectiosité doit être déterminée pour chaque nouveau « lot ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Winnie Zhao et Yin Chen Wan d’avoir fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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