Summary

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

Abstract

חסינות תורשתית מתארת כיצד בעלי חיים מסוימים יכולים להעביר את “הזיכרון” של זיהום קודם לצאצאיהם. זה יכול להגביר את עמידות הפתוגנים בצאצאיהם ולקדם הישרדות. בעוד שחסינות תורשתית דווחה אצל חסרי חוליות רבים, המנגנונים העומדים בבסיס תופעה אפיגנטית זו אינם ידועים במידה רבה. הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הפתוגן המיקרוספורידיאני הטבעי Nematocida parisii גורם לתולעים לייצר צאצאים עמידים מאוד למיקרוספורידיה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות בין-דורית במודל ההדבקה הפשוט והניתן לגישה גנטית של N. parisii C. elegans . המאמר הנוכחי מתאר שיטות להדבקת C. elegans ולייצור צאצאים בעלי סיכון. שיטות ניתנות גם לבדיקת עמידות לזיהום מיקרוספורידיה על ידי צביעה למיקרוספורידיה והדמיה של זיהום על ידי מיקרוסקופיה. בפרט, חסינות תורשתית מונעת פלישת תאים מארחים על ידי מיקרוספורידיה, וניתן להשתמש בהכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לכמת אירועי פלישה. ניתן לכמת את הכמות היחסית של נבגי מיקרוספורידיה המיוצרים בצאצאים בעלי קדם חיסוני על ידי צביעת הנבגים בצבע הקושר כיטין. עד כה, שיטות אלה שפכו אור על הקינטיקה ועל הספציפיות הפתוגנית של חסינות תורשתית, כמו גם על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסה. טכניקות אלה, לצד הכלים הנרחבים העומדים לרשות המחקר של C. elegans , יאפשרו תגליות חשובות בתחום החסינות התורשתית.

Introduction

חסינות תורשתית היא תופעה אפיגנטית לפיה חשיפה הורית לפתוגנים יכולה לאפשר ייצור של צאצאים עמידים לזיהומים. סוג זה של זיכרון חיסוני הוכח אצל חסרי חוליות רבים חסרי מערכת החיסון הנרכשת ויכולים להגן מפני מחלות ויראליות, חיידקיות ופטרייתיות1. בעוד שלחסינות תורשתית יש השלכות חשובות הן על הבנת הבריאות והן על האבולוציה, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הגנה זו אינם ידועים במידה רבה. זאת, בין היתר, משום שרבים מבעלי החיים שבהם תוארה חסינות תורשתית אינם אורגניזמים מבוססים למחקר. לעומת זאת, מחקרים בנמטודה השקופה Caenorhabditis elegans נהנים מארגז כלים גנטי וביוכימי נרחב 2,3, גנום מבואר מאוד 4,5, וזמן דור קצר. ואכן, המחקר ב- C. elegans איפשר התקדמות בסיסית בתחומי האפיגנטיקה והחסינות המולדת 6,7, וכיום הוא מודל מבוסס לחקרהזיכרון החיסוני 8,9.

מיקרוספורידיה הם פתוגנים פטרייתיים שמדביקים כמעט את כל בעלי החיים וגורמים לזיהומים קטלניים בבני אדם מדוכאי חיסון10. זיהום מתחיל כאשר נבג מיקרוספורידיה מזריק או “יורה” את התוכן התאי שלו (sporoplasm) לתוך תא מארח באמצעות מבנה שנקרא צינור קוטב. שכפול תוך-תאי של הטפיל גורם להיווצרות של מרונטים, אשר בסופו של דבר מתמיינים לנבגים בוגרים שיכולים לצאת מהתא11,12. בעוד שטפילים אלה מזיקים הן לבריאות האדם והן לביטחון התזונתי, יש עדיין הרבה מה ללמוד על הביולוגיה הזיהומית שלהם12. Nematocida parisii הוא טפיל מיקרוספורידיאני טבעי המשתכפל אך ורק בתאי המעי של התולעים, וכתוצאה מכך מופחת הנקבוביות, ובסופו של דבר למוות. מודל ההדבקה של N. parisii C. elegans שימש כדי להראות: (1) את התפקיד של אוטופגיה בפינוי פתוגנים13, (2) כיצד מיקרוספורידיה יכולה לצאת מתאים נגועים באופן לא ליטי14, (3) כיצד פתוגנים יכולים להתפשט מתא לתא על ידי יצירת סינקטיה15, (4) החלבונים שבהם N. parisii משתמש כדי להתממשק עם המארח שלה16, ו-(5) ויסות תגובת הפתוגן התוך-תאי השעתוק (IPR)17, 18.

פרוטוקולים לזיהום של C. elegans מתוארים בעבודה הנוכחית וניתן להשתמש בהם כדי לחשוף את הביולוגיה הייחודית של מיקרוספורידיה ולנתח את תגובת המארח לזיהום. המיקרוסקופיה של תולעים קבועות המוכתמות בצבע הקושר כיטין Direct Yellow 96 (DY96) מראה את התפשטות הזיהום של נבגי מיקרוספורידיה המכילים כיטין ברחבי המעי. צביעת DY96 מאפשרת גם הדמיה של עוברי תולעים המכילים כיטין לצורך הערכה סימולטנית של כוח המשיכה של התולעים (היכולת לייצר עוברים) כקריאה של כושר המארח.

עבודות אחרונות גילו כי C. elegans נגועים ב – N. parisii מייצרים צאצאים שעמידים מאוד לאותו זיהום19. חסינות תורשתית זו נמשכת דור אחד ותלויה במינון, שכן צאצאים מהורים נגועים יותר עמידים יותר בפני מיקרוספורידיה. באופן מעניין, הצאצאים בעלי הפריים של N. parisii גם עמידים יותר בפני פתוגן המעי החיידקי Pseudomonas aeruginosa, אם כי הם אינם מוגנים מפני הפתוגן הטבעי Orsay virus19. העבודה הנוכחית מראה גם כי צאצאים בעלי כוונה חיסונית מגבילים את פלישת התאים המארחים על ידי מיקרוספורידיה. השיטה מתארת גם את איסוף הצאצאים בעלי ההון החיסוני וכיצד ניתן להשתמש ב-FISH כדי לזהות N. parisii RNA בתאי מעיים כדי לבחון פלישה של תאים מארחים ולירותנבגים 20.

יחד, פרוטוקולים אלה מספקים בסיס מוצק לחקר מיקרוספורידיה וחסינות תורשתית ב- C. elegans. התקווה היא שעבודה עתידית במערכת מודלים זו תאפשר תגליות חשובות בתחום המתהווה של חסינות תורשתית. טכניקות אלה עשויות גם להיות נקודות מוצא לחקר חסינות תורשתית הנגרמת על ידי מיקרוספורידיה באורגניזמים מארחים אחרים.

Protocol

המחקר הנוכחי משתמש בזן בריסטול N2 מסוג C. elegans מסוג בר שגדל ב-21 מעלות צלזיוס. 1. הכנת מדיה הכן מדיה M9 לפי הדו”ח הקודם21,22. להכין מדיום צמיחת נמטודות (NGM) לפי הדו”ח הקודם21,22. יוצקים 12 מ”ל של NGM לכל …

Representative Results

במחקר הנוכחי, אוכלוסיות הורים של C. elegans (P0) נדבקו בשלב L1 עם מינון נמוך של נבגי N. parisii . תנאי זיהום אלה משמשים בדרך כלל להשגת מספר גבוה של צאצאי F1 עמידים למיקרוספורידיה באמצעות הלבנה של ההורים. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות נקבעו ב-72 hpi והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעי…

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את חקר המיקרוספורידיה והחסינות התורשתית במודל זיהום פשוט וניתן למתיחה גנטית של N. parisii C. elegans .

הכנת נבגים היא פרוטוקול אינטנסיבי שבדרך כלל מניב מספיק נבגים במשך 6 חודשים של ניסויים, בהתאם לפרודוקטיביות24. חשוב לציין, יש לקבוע את הה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לוויני ז’או וליין צ’ן וואן על מתן הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק #522691522691).

Materials

2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

References

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Play Video

Cite This Article
Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

View Video