微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究
Summary
微胞子虫寄生虫ネマトシダ・パリシイによるCaenorhabditis elegansの感染は、ワームが同じ病原体に対して非常に耐性のある子孫を産むことを可能にする。これは遺伝性免疫の一例であり、り理解されていないエピジェネティック現象である。本プロトコールは、遺伝的に扱いやすいワームモデルにおける遺伝性免疫の研究を記述している。
Abstract
遺伝性免疫は、いくつかの動物が以前の感染の「記憶」を子孫にどのように渡すことができるかを表しています。これは、子孫の病原体耐性を高め、生存を促進することができる。遺伝性免疫は多くの無脊椎動物で報告されているが、このエピジェネティック現象の根底にあるメカニズムはほとんど知られていない。天然の微胞子虫病原体ネマトシダ・パリシイによるカエノラブディティス・エレガンスの感染は、微胞子虫に対して頑丈に耐性のある子孫を産生するワームをもたらす。本プロトコールは、単純かつ遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける世代間免疫の研究を記載する。現在の記事では、C. elegansに感染し、免疫プライムされた子孫を生成する方法について説明します。微胞子虫の染色および顕微鏡による感染の可視化による微胞子虫感染に対する耐性をアッセイするための方法も与えられる。特に、遺伝性免疫は微胞子虫による宿主細胞の侵入を防ぎ、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて浸潤事象を定量化することができる。免疫プライミングされた子孫において産生される微胞子虫胞子の相対量は、胞子をキチン結合色素で染色することによって定量することができる。今日まで、これらの方法は、遺伝性免疫の動態および病原体特異性、ならびにその根底にある分子メカニズムに光を当ててきた。これらの技術は、C. elegansの研究に利用可能な広範なツールとともに、遺伝性免疫の分野における重要な発見を可能にするでしょう。
Introduction
遺伝性免疫はエピジェネティックな現象であり、それによって親が病原体にさらされ、感染抵抗性の子孫の産生を可能にすることができる。このタイプの免疫記憶は、適応免疫系を欠いており、ウイルス性、細菌性、および真菌性の疾患から保護することができる多くの無脊椎動物で示されている1。遺伝性免疫は健康と進化の両方を理解する上で重要な意味を持つが、この保護の根底にある分子メカニズムはほとんど知られていない。これは、遺伝性免疫が記載されている動物の多くが、研究のためのモデル生物として確立されていないことも一因である。対照的に、透明な線虫Caenorhabditis elegansにおける研究は、広範な遺伝的および生化学的ツールキット2,3、高度に注釈付きゲノム4,5、および短い生成時間から利益を得る。実際、C. elegansの研究は、エピジェネティクスと自然免疫6,7の分野における根本的な進歩を可能にし、現在は免疫記憶8,9を研究するための確立されたモデルです。
微胞子虫は、ほぼすべての動物に感染し、免疫不全のヒトに致死的な感染症を引き起こす真菌病原体です10。感染は、微胞子虫胞子が極性管と呼ばれる構造を使用して宿主細胞にその細胞内容物(スポロプラズム)を注入または「発火」したときに始まります。寄生虫の細胞内複製は、メロントの形成をもたらし、これは最終的に細胞11、12を出ることができる成熟胞子に分化する。これらの寄生虫は人間の健康と食料安全保障の両方に有害ですが、感染生物学についてはまだ学ぶべきことがたくさんあります12。線虫パリシイは、ワームの腸細胞内で排他的に複製する天然のマイクロスポリジウム寄生虫であり、繁殖力の低下、そして最終的には死をもたらす。N. parisii-C. elegans感染モデルは、(1)病原体クリアランスにおけるオートファジーの役割13、(2)微胞子虫が感染細胞から非溶解的にどのように出ることができるか14、(3)病原体が合胞体15を形成することによって細胞から細胞へとどのように広がることができるか、(4)N. parisiiが宿主16と界面するために用いるタンパク質、および(5)転写細胞内病原体応答(IPR)17の調節、18。
C. elegansの感染に関するプロトコルは、現在の研究に記載されており、ユニークな微胞子虫生物学を明らかにし、感染に対する宿主の応答を解剖するために使用することができる。キチン結合色素Direct Yellow 96(DY96)で染色された固定ワームの顕微鏡観察は、キチン含有微胞子虫胞子の腸全体に感染が広がることを示している。DY96染色はまた、宿主の適応度の読み出しとしてワームの重力(胚を産生する能力)の同時評価のために、キチン含有ワーム胚の視覚化を可能にする。
最近の研究により、N. parisiiに感染したC. elegansは、同じ感染に対して頑丈に耐性のある子孫を産むことが明らかになりました19。この遺伝性免疫は単一世代持続し、より重度に感染した両親からの子孫が微胞子虫に対してより耐性であるため、用量依存的である。興味深いことに、N. parisii-primedの子孫はまた、細菌の腸内病原体緑膿菌に対してより耐性があるが、天然の病原体オルセーウイルス19に対して保護されていない。本研究はまた、免疫プライムされた子孫が微胞子虫による宿主細胞の侵入を制限することを示している。この方法はまた、免疫プライミングされた子孫の収集と、FISHを使用して腸細胞中のN. parisii RNAを検出し、宿主細胞の侵入および胞子の発火をアッセイする方法についても説明しています20。
これらのプロトコルは、 C. elegansにおける微胞子虫および遺伝性免疫を研究するための強固な基盤を提供する。このモデルシステムにおける今後の研究により、遺伝性免疫の新生領域における重要な発見が可能になることが期待されます。これらの技術は、他の宿主生物における微胞子虫誘発遺伝性免疫を調査するための出発点となる可能性もある。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコールは、単純で遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける微胞子虫および遺伝性免疫の研究を記載する。
胞子調製は、生産性に応じて、典型的には6ヶ月間の実験に十分な胞子を生じる集中的なプロトコールである24。重要なことに、感染力は、実験に使用する前に、新しい胞子「ロット」ごとに決定されなければ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ウィニー・ジャオとイン・チェン・ワンが原稿について有益なコメントをくれたことに感謝しています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(Grant #522691522691)の支援を受けた。
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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