Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas
Summary
O aumento da taxa de análises farmaco-e toxicoléticas de metais e compostos à base de metal em zebrafish pode ser vantajoso para estudos de tradução ambiental e clínica. A limitação da absorção de exposição transmitida pela água desconhecida foi superada pela realização de análises metálicas de traços no tecido de zebrafish digerido usando espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada.
Abstract
Metais e compostos à base de metal compreendem xenobióticos farmaco-ativos e toxicológicos multifásicos. Da toxicidade do metal pesado à quimioterapia, os toxicokinetics desses compostos têm relevância histórica e moderna. Os zebrafish tornaram-se um organismo modelo atraente na elucidação da farmaco e toxicopinatics em estudos de exposição ambiental e tradução clínica. Embora os estudos de zebrafish tenham o benefício de serem mais bem-colocados do que os modelos de roedores, existem várias restrições significativas ao modelo.
Uma dessas limitações é inerente ao regime de dosagem aquaviário. As concentrações de água desses estudos não podem ser extrapoladas para fornecer doses internas confiáveis. Medições diretas dos compostos à base de metal permitem uma melhor correlação com respostas moleculares e biológicas relacionadas a compostos. Para superar essa limitação para metais e compostos à base de metal, desenvolveu-se uma técnica para digerir tecido larval de zebrafish após exposição e quantificar concentrações metálicas dentro de amostras de tecido por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICPMS).
Métodos ICPMS foram usados para determinar as concentrações metálicas de platina (Pt) de cisplatina e rutênio (Ru) de várias quimioterapias baseadas em Ru em tecido de zebrafish. Além disso, este protocolo distinguiu concentrações de Pt que foram sequestradas no acorde da larva em comparação com o tecido zebrafish. Estes resultados indicam que este método pode ser aplicado para quantificar a dose metálica presente nos tecidos larvais. Além disso, este método pode ser ajustado para identificar metais específicos ou compostos à base de metal em uma ampla gama de estudos de exposição e dosagem.
Introduction
Metais e compostos metálicos continuam a ter relevância farmacológica e toxicológica. A prevalência de exposição ao metal pesado e seu impacto na saúde aumentou exponencialmente a investigação científica desde a década de 1960 e atingiu um recorde em 2021. As concentrações de metais pesados na água potável, poluição do ar e exposição ocupacional excedem os limites regulatórios em todo o mundo e permanecem um problema para arsênico, cádmio, mercúrio, cromo, chumbo e outros metais. Novos métodos para quantificar a exposição ambiental e analisar o desenvolvimento patológico continuam em alta demanda 1,2,3.
Por outro lado, a área médica tem aproveitado as propriedades fisioquímicas de vários metais para tratamento clínico. Drogas à base de metal ou metalúrgicos têm uma rica história de fins medicinais e têm mostrado atividade contra uma série de doenças, com o maior sucesso como quimioterapia4. O mais famoso dos metalodrogas, cisplatina, é um medicamento anticâncer baseado em Pt considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma das drogas essenciais do mundo5. Em 2010, a cisplatina e seus derivados do Pt tiveram até 90% de sucesso em diversos cânceres e foram utilizadas em aproximadamente 50% dos regimes de quimioterapia 6,7,8. Embora a quimioterapia baseada em PT tenha tido sucesso irrefutável, a toxicidade limitante de dose iniciou investigações de drogas à base de metal alternativo com entrega biológica refinada e atividade. Dessas alternativas, os compostos baseados em Ru tornaram-se os 9,10,11,12 mais populares.
Novos modelos e metodologia são necessários para acompanhar a taxa de necessidade de estudos farmaco-farmaco e toxicolíticos metálicos. O modelo de zebrafish está na intersecção de complexidade e throughput, sendo um vertebrado de alta fecundidade com 70% de homologia genética conservada13. Este modelo tem sido um ativo em farmacologia e toxicologia, com extensas triagens para vários compostos para descoberta de chumbo, identificação de alvos e atividade mecanicística 14,15,16,17. No entanto, a triagem de alto rendimento de produtos químicos normalmente depende de exposições transmitidas pela água. Dado que a absorção pode ser variável com base nas propriedades físico-químicas do composto na solução (ou seja, fotodegradação, solubilidade), isso pode ser uma grande limitação de correlacionar a entrega e a resposta das doses.
Para superar essa limitação para comparação da dose com vertebrados mais elevados, foi projetada uma metodologia para analisar as concentrações metálicas de traço no tecido larval de zebrafish. Aqui, curvas de dose-resposta de pontos finais letais e subletais foram avaliadas para cisplatina e novos compostos anticancerígenos baseados em Ru. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e a absorção de organismos das respectivas doses foi de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) por organismo. Além disso, as larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12,4 mg/L de PMC79. Estas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo também permitiu a distinção das concentrações de Pt sequestrado no acorde das larvas em comparação com o tecido zebrafish. Essa metodologia foi capaz de fornecer dados confiáveis e robustos para comparações da atividade farmaco-e toxicolética entre um quimioterápico bem estabelecido e um novo composto. Este método pode ser aplicado a uma ampla gama de metais e compostos à base de metal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito foi implementado para determinar a entrega e a absorção de drogas anticancerígenas baseadas em metal contendo Pt ou Ru. Embora esses métodos já tenham sido publicados, este protocolo discute considerações e detalhes importantes para adaptar essa metodologia para uma variedade de compostos. O protocolo da OCDE, juntamente com a digestão tecidual e a análise do ICPMS, nos permitiu determinar que o PMC79 era mais potente que a cisplatina e resultou em acúmulo de tecidos díspares, sugerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Além disso, Brittany Karas é apoiada pela concessão de treinamento T32NS115700 da NINDS, NIH. Os autores reconhecem Andreia Valente e a Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT); PTDC/QUI-QIN/28662/2017) para o fornecimento de PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
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