Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie
Summary
L’aumento del tasso di analisi farmaco-e tossicocinetiche di metalli e composti a base di metalli nel pesce zebra può essere vantaggioso per gli studi di traduzione ambientale e clinica. La limitazione dell’assorbimento sconosciuto dell’esposizione all’acqua è stata superata conducendo analisi di metalli in tracce su tessuto zebrafish digerito utilizzando la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente.
Abstract
I metalli e i composti a base di metalli comprendono molteplici xenobiotici farmacoattivi e tossicologici. Dalla tossicità dei metalli pesanti ai chemioterapici, la tossicocinetica di questi composti ha rilevanza sia storica che moderna. I pesci zebra sono diventati un organismo modello attraente nel chiarire la farmacocinetica e la tossicocinetica negli studi di esposizione ambientale e traduzione clinica. Sebbene gli studi sui pesci zebra abbiano il vantaggio di avere un rendimento più elevato rispetto ai modelli di roditori, ci sono diversi vincoli significativi al modello.
Una di queste limitazioni è inerente al regime di dosaggio a base acquosa. Le concentrazioni di acqua da questi studi non possono essere estrapolate per fornire dosaggi interni affidabili. Le misurazioni dirette dei composti a base di metalli consentono una migliore correlazione con le risposte molecolari e biologiche correlate ai composti. Per superare questa limitazione per i metalli e i composti a base di metalli, è stata sviluppata una tecnica per digerire il tessuto larvale del pesce zebra dopo l’esposizione e quantificare le concentrazioni di metalli all’interno dei campioni di tessuto mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICPMS).
I metodi ICPMS sono stati utilizzati per determinare le concentrazioni metalliche di platino (Pt) da cisplatino e rutenio (Ru) da diversi nuovi chemioterapici a base di Ru nel tessuto zebrafish. Inoltre, questo protocollo distingueva le concentrazioni di Pt che venivano sequestrate nel coro della larva rispetto al tessuto del pesce zebra. Questi risultati indicano che questo metodo può essere applicato per quantificare la dose di metallo presente nei tessuti larvali. Inoltre, questo metodo può essere adattato per identificare metalli specifici o composti a base di metalli in una vasta gamma di studi di esposizione e dosaggio.
Introduction
I metalli e i composti a base di metalli continuano ad avere rilevanza farmacologica e tossicologica. La prevalenza dell’esposizione ai metalli pesanti e il suo impatto sulla salute hanno aumentato esponenzialmente le indagini scientifiche dal 1960 e hanno raggiunto il massimo storico nel 2021. Le concentrazioni di metalli pesanti nell’acqua potabile, nell’inquinamento atmosferico e nell’esposizione professionale superano i limiti normativi in tutto il mondo e rimangono un problema per arsenico, cadmio, mercurio, cromo, piombo e altri metalli. Nuovi metodi per quantificare l’esposizione ambientale e analizzare lo sviluppo patologico continuano ad essere molto richiesti 1,2,3.
Al contrario, il campo medico ha sfruttato le proprietà fisiochimiche di vari metalli per il trattamento clinico. I farmaci a base di metalli o metallofarmaci hanno una ricca storia di scopi medicinali e hanno mostrato attività contro una serie di malattie, con il più alto successo come chemioterapici4. Il più famoso dei metallofarmaci, il cisplatino, è un farmaco antitumorale a base di Pt considerato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come uno dei farmaci essenziali del mondo5. Nel 2010, il cisplatino e i suoi derivati del Pt hanno avuto un tasso di successo fino al 90% in diversi tumori e sono stati utilizzati in circa il 50% dei regimichemioterapici 6,7,8. Sebbene i chemioterapici a base di Pt abbiano avuto un successo inconfutabile, la tossicità dose-limitante ha messo in moto indagini su farmaci alternativi a base di metalli con somministrazione e attività biologica raffinata. Di queste alternative, i composti a base di Ru sono diventati i più popolari 9,10,11,12.
Sono necessari nuovi modelli e metodologie per tenere il passo con il tasso di necessità di studi di farmacocinetica e tossicocinetica sui metalli. Il modello del pesce zebra si trova all’intersezione tra complessità e produttività, essendo un vertebrato ad alta fecondità con il 70% di omologia genica conservata13. Questo modello è stato una risorsa in farmacologia e tossicologia, con ampi screening per vari composti per la scoperta di piombo, l’identificazione del bersaglio e l’attività meccanicistica 14,15,16,17. Tuttavia, lo screening ad alta produttività delle sostanze chimiche si basa in genere sulle esposizioni trasmesse dall’acqua. Dato che l’assorbimento può essere variabile in base alle proprietà fisico-chimiche del composto in soluzione (cioè fotodegradazione, solubilità), questo può essere un importante limite di correlazione tra l’erogazione della dose e la risposta.
Per superare questa limitazione per il confronto della dose con i vertebrati superiori, è stata progettata una metodologia per analizzare le concentrazioni di metalli in tracce nel tessuto larvale del pesce zebra. Qui, le curve dose-risposta degli endpoint letali e subletali sono state valutate per il cisplatino e nuovi composti antitumorali a base di Ru. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per concentrazioni nominali di 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L di cisplatino. L’accumulo di Pt nel tessuto dell’organismo è stato determinato dall’analisi ICPMS e l’assorbimento da parte dell’organismo delle rispettive dosi è stato di 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) per organismo. Inoltre, le larve di zebrafish sono state esposte a 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / L di PMC79. Queste concentrazioni sono state determinate analiticamente per contenere 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/ L di Ru. Questo protocollo consentiva anche la distinzione delle concentrazioni di Pt sequestrate nel coro delle larve rispetto al tessuto del pesce zebra. Questa metodologia è stata in grado di fornire dati affidabili e solidi per il confronto dell’attività farmaco-tossicocinetica tra un chemioterapico ben consolidato e un nuovo composto. Questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di metalli e composti a base di metalli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato implementato per determinare la somministrazione e l’assorbimento di farmaci antitumorali a base di metalli contenenti Pt o Ru. Sebbene questi metodi siano già stati pubblicati, questo protocollo discute importanti considerazioni e dettagli per adattare questa metodologia a una serie di composti. Il protocollo OCSE abbinato alla digestione dei tessuti e all’analisi ICPMS ci ha permesso di determinare che il PMC79 era più potente del cisplatino e ha provocato un accumulo di tessuto d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Inoltre, Brittany Karas è supportata dalla borsa di formazione T32NS115700 di NINDS, NIH. Gli autori riconoscono Andreia Valente e la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) per la fornitura di PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
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