Dosisaufnahme der platin- und rutheniumbasierten Verbindungsexposition in Zebrafischen durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma mit breiteren Anwendungen
Summary
Die erhöhte Rate pharmako- und toxikokinetischer Analysen von Metallen und metallbasierten Verbindungen in Zebrafischen kann für Umwelt- und klinische Translationsstudien von Vorteil sein. Die Begrenzung der unbekannten Wasserexpositionsaufnahme wurde durch die Durchführung von Spurenmetallanalysen an verdautem Zebrafischgewebe unter Verwendung der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma überwunden.
Abstract
Metalle und metallbasierte Verbindungen umfassen vielfältige pharmakoaktive und toxikologische Xenobiotika. Von der Schwermetalltoxizität bis hin zu Chemotherapeutika hat die Toxikokinetik dieser Verbindungen sowohl historische als auch moderne Relevanz. Zebrafische sind zu einem attraktiven Modellorganismus für die Aufklärung der Pharmako- und Toxikokinetik in Umweltexpositions- und klinischen Translationsstudien geworden. Obwohl Zebrafischstudien den Vorteil haben, dass sie einen höheren Durchsatz haben als Nagetiermodelle, gibt es mehrere signifikante Einschränkungen für das Modell.
Eine solche Einschränkung ist dem wässrigen Dosierungsschema inhärent. Die Wasserkonzentrationen aus diesen Studien können nicht extrapoliert werden, um zuverlässige interne Dosierungen zu liefern. Direkte Messungen der metallbasierten Verbindungen ermöglichen eine bessere Korrelation mit verbindungsbezogenen molekularen und biologischen Antworten. Um diese Einschränkung für Metalle und metallbasierte Verbindungen zu überwinden, wurde eine Technik entwickelt, um Zebrafischlarvengewebe nach der Exposition zu verdauen und Metallkonzentrationen in Gewebeproben durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICPMS) zu quantifizieren.
ICPMS-Methoden wurden verwendet, um die Metallkonzentrationen von Platin (Pt) aus Cisplatin und Ruthenium (Ru) aus mehreren neuartigen Ru-basierten Chemotherapeutika im Zebrafischgewebe zu bestimmen. Darüber hinaus unterschied dieses Protokoll Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larve sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode angewendet werden kann, um die in Larvengeweben vorhandene Metalldosis zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode angepasst werden, um bestimmte Metalle oder metallbasierte Verbindungen in einem breiten Spektrum von Expositions- und Dosierungsstudien zu identifizieren.
Introduction
Metalle und metallbasierte Verbindungen haben nach wie vor pharmakologische und toxikologische Relevanz. Die Prävalenz der Schwermetallexposition und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit haben die wissenschaftlichen Untersuchungen seit den 1960er Jahren exponentiell erhöht und 2021 ein Allzeithoch erreicht. Die Konzentrationen von Schwermetallen im Trinkwasser, die Luftverschmutzung und die berufliche Exposition überschreiten weltweit die gesetzlichen Grenzwerte und bleiben ein Problem für Arsen, Cadmium, Quecksilber, Chrom, Blei und andere Metalle. Neuartige Methoden zur Quantifizierung der Umweltexposition und zur Analyse der pathologischen Entwicklung sind nach wie vor sehr gefragt 1,2,3.
Umgekehrt hat der medizinische Bereich die physiochemischen Eigenschaften verschiedener Metalle für die klinische Behandlung genutzt. Metallbasierte Medikamente oder Metallodrugs haben eine reiche Geschichte von medizinischen Zwecken und haben Aktivität gegen eine Reihe von Krankheiten gezeigt, mit dem höchsten Erfolg als Chemotherapeutika4. Das berühmteste Metallodrug, Cisplatin, ist ein Pt-basiertes Krebsmedikament, das von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als eines der wichtigsten Medikamente der Welt eingestuftwird 5. Im Jahr 2010 hatten Cisplatin und seine Pt-Derivate bei mehreren Krebsarten eine Erfolgsrate von bis zu 90% und wurden in etwa 50% der Chemotherapien verwendet 6,7,8. Obwohl Pt-basierte Chemotherapeutika unwiderlegbaren Erfolg hatten, hat die dosislimitierende Toxizität Untersuchungen alternativer metallbasierter Medikamente mit verfeinerter biologischer Verabreichung und Aktivität in Gang gesetzt. Von diesen Alternativen sind Ru-basierte Verbindungen zu den beliebtesten 9,10,11,12 geworden.
Neuartige Modelle und Methoden sind erforderlich, um mit dem Bedarf an pharmakologischen und toxikokinetischen Metallstudien Schritt zu halten. Das Zebrafischmodell liegt an der Schnittstelle von Komplexität und Durchsatz, da es sich um ein Wirbeltier mit hoher Fruchtbarkeit mit 70% konservierter Genhomologiehandelt 13. Dieses Modell war ein Vorteil in der Pharmakologie und Toxikologie, mit umfangreichen Screenings für verschiedene Verbindungen für die Entdeckung von Blei, Zielidentifizierung und mechanistische Aktivität14,15,16,17. Das Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien hängt jedoch typischerweise von wässrigen Expositionen ab. Da die Aufnahme aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung in Lösung (d. h. Photodegradation, Löslichkeit) variabel sein kann, kann dies eine wesentliche Einschränkung der korrelierenden Dosisabgabe und des Ansprechens sein.
Um diese Einschränkung für den Vergleich der Dosis mit höheren Wirbeltieren zu überwinden, wurde eine Methodik entwickelt, um die Spurenmetallkonzentrationen im Zebrafischlarvengewebe zu analysieren. Hier wurden Dosis-Wirkungs-Kurven tödlicher und subletaler Endpunkte für Cisplatin und neuartige Ru-basierte Krebsmedikamente ausgewertet. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden auf nominale Konzentrationen von 0, 3,75, 7,5, 15, 30 und 60 mg/L Cisplatin untersucht. Die Pt-Akkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und die Aufnahme der jeweiligen Dosen durch den Organismus betrug 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 und 461,9 ng (Pt) pro Organismus. Zusätzlich wurden Zebrafischlarven bei 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79 exponiert. Diese Konzentrationen wurden analytisch so bestimmt, dass sie 0, 0,17, 0,44, 0,66 und 0,76 mg/L Ru enthielten. Dieses Protokoll ermöglichte auch die Unterscheidung von Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larven sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Methodik war in der Lage, zuverlässige, robuste Daten für Vergleiche der pharmako- und toxikokinetischen Aktivität zwischen einem gut etablierten Chemotherapeutikum und einer neuartigen Verbindung zu liefern. Diese Methode kann auf eine breite Palette von Metallen und metallbasierten Verbindungen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde implementiert, um die Verabreichung und Aufnahme von metallbasierten Krebsmedikamenten zu bestimmen, die entweder Pt oder Ru enthalten. Obwohl diese Methoden bereits veröffentlicht wurden, diskutiert dieses Protokoll wichtige Überlegungen und Details, um diese Methodik für eine Reihe von Verbindungen anzupassen. Das OECD-Protokoll in Verbindung mit der Gewebeverdauung und der ICPMS-Analyse ermöglichte es uns, festzustellen, dass PMC79 wirksamer als Cisplatin war und zu einer unte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Förderung: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Darüber hinaus wird Brittany Karas durch den Schulungszuschuss T32NS115700 von NINDS, NIH, unterstützt. Die Autoren würdigen Andreia Valente und die portugiesische Stiftung für Wissenschaft und Technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) für die Lieferung von PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
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