Визуализация миграции нейтрофилов в коже мыши для исследования ремоделирования субклеточных мембран в физиологических условиях

Все эксперименты и процедуры на животных были одобрены Национальным институтом рака (National Institutes of Health, Bethesda, MD, США) Комитетом по уходу и использованию животных (протоколы LCMB-031 и LCMB-035) и соответствовали всем соответствующим этическим нормам. Для экспериментов использовались как самцы, так и самки мышей в возрасте от 2 до 6 месяцев. Мыши-хозяева mT/mG и мыши дикого типа (WT) находятся на фоне FVB/NJ, в то время как мыши LyzM-Cre x mTmG находятся на фоне C57BL/6. 1. Материалы и подготовка реагентов и инструментов Смажьте тюбики, посуду и иглы/шприцы PBS + 1% BSA (без кальция и магния) на ночь при перемешивании. Тщательно очищайте поверхности и инструменты/инструменты, используемые для работы с животными, с использованием этанола на 70% или путем автоклавирования.Для очистки нейтрофилов подготовьте следующее: 3 пробирки по 15 мл, 1 чашка 60 мм, 1 пробирка по 1,5 мл; HBSS, содержащий 10 mM HEPES (pH 7,3); раствор для лизиса эритроцитов (ACK); Histopaque 1077; и Histopaque 1119. Для инъекций нейтрофилов приготовьте следующее: 1 штприц малого объема (10 мкл), 1 иглу со скошенной углом по 33 г, изофлуран и раствор для анестезии (кетамин, ксилазин и ацепромазин в дозе 80 мг·кг-1, 2 мг·кг-1 и 4 мг·кг-1 соответственно, в физиологическом растворе). 2. Очищение нейтрофилов от мыши-донора Усыпьте мышь-донора в соответствии с местными институциональными правилами. Соберите у животного длинные кости (бедренную кость, большеберцовую кость и плечевую кость), уделяя внимание сохранению целостности костей и избегая порезов головок костей во время сбора24. В посуде диаметром 60 мм с покрытием BSA удалите мышцы и жировую ткань. Разрежьте головки костей, чтобы получить доступ к костному мозгу, а затем промойте и гомогенизируйте костный мозг с помощью шприца (игла 27 G), наполненного HBSS. Отфильтруйте раствор в пробирку с покрытием BSA объемом 15 мл с помощью фильтра 40 мкм и центрифугируйте его при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 1 мл ACK на 30 с для лизирования эритроцитов, а затем добавьте 9 мл HBSS для остановки лизиса. Центрифугируйте раствор при 400 x g в течение 5 минут при RT. Приготовьте ступенчатый градиент плотности в пробирке объемом 15 мл с покрытием BSA, аккуратно поместив 4 мл 1119 Histopaque на дно пробирки, а затем аккуратно наложив 4 мл 1077 Histopaque на верхнюю часть. Будьте особенно осторожны, чтобы не перепутать два слоя. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл HBSS. Аккуратно нанесите раствор поверх ступенчатого градиента, приготовленного выше. Вращайтесь со скоростью 1 000 x g в течение 30 минут на RT с минимально возможной скоростью ускорения и замедления («предпочтительно без тормоза»). Из верхней части пробирки аккуратно отсасывайте половину слоя 1077 Histopaque. Соберите оставшуюся половину слоя 1077 Histopaque и верхнюю половину слоя 1119 Histopaque в свежую пробирку с покрытием BSA. Мутная клеточная суспензия между двумя слоями плотности содержит преимущественно нейтрофилы. Добавьте HBSS до конечного объема 15 мл и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Вращайте при 400 x g в течение 5 минут по RT. После центрифугирования повторно суспензируйте и промойте клеточную гранулу 10 мл HBSS и отжмите при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите процедуру, а затем повторно суспендируйте гранулу в 15 мл HBSS, чтобы определить количество клеток с помощью счетчика клеток. Наконец, спин и ресуспендирование клеток в 1 мл HBSS и перенос в пробирку, покрытую BSA объемом 1,5 мл. После очистки суспензию нейтрофилов в пробирке, покрытой БСА, выдерживают при осторожном перемешивании в течение 30 минут на ротаторе пробирки при ЛТ до мечения и/или инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная очистка дает 10-20 x 106 нейтрофилов на мышь с чистотой 95%. Чистоту оценивают с помощью проточной цитометрии с использованием ранее описанных нейтрофильных маркеров (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ и CD11b+)25,26.ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы по выделению нейтрофилов из периферической крови человека и костного мозга мышей доступны ранее24,27. 3. Мечение нейтрофилов Примечание: Чтобы визуализировать нейтрофилы, они были выделены из мышей LyzM-Cre mT/mG , у которых миелоидные клетки экспрессируют мембранно-целевой пептид, слитый с GFP. Кроме того, очищенные нейтрофилы от мышей дикого типа (WT) были помечены in vitro. Следующие шаги описывают процедуру, используемую для мечения очищенных нейтрофилов коммерческим проникающим в клетки зеленым флуоресцентным красителем, и могут быть адаптированы к любому другому совместимому с МПМ флуоресцентному зонду по выбору. Добавьте зеленый флуоресцентный краситель (рекомендуемая производителем концентрация; в данном случае 1 мкМ) в суспензию нейтрофилов (очищенную от мыши WT) в пробирке, покрытой 1,5 мл БСА. Инкубировать в течение 30 мин при РТ при осторожном перемешивании в ротаторе с трубкой. Промойте три раза с использованием HBSS, отжмите при 400 x g в течение 5 минут при RT и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл HBSS. Суспензию нейтрофилов в пробирке, покрытой БСА, выдерживают при осторожном перемешивании в ротаторе трубки при ЛТ до процедуры инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Введение меченых нейтрофилов, проводимое сразу после мечения, является весьма предпочтительным. Однако при необходимости меченые нейтрофилы можно держать в состоянии перемешивания в течение дополнительных 10-15 мин после мечения без нарушения целостности ответа нейтрофилов in vivo. Длительное возбуждение (более 60 минут после мечения) приведет к сгущению, гибели нейтрофилов и вводящим в заблуждение наблюдениям in vivo. Непосредственно перед инъекцией суспендируйте клеточную гранулу в физиологическом растворе до плотности 2-5 х 106 клеток на 20 мкл. 4. Инъекция нейтрофилов ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия должна проводиться в соответствии с рекомендациями местного Комитета по уходу за животными и их использованию. Поместите животное в закрытую камеру и введите 3%-5% изофлурана (расход 2 л/мин) с помощью калиброванного испарителя, подключенного к кислородному концентратору. Оцените, находится ли животное в бессознательном состоянии, проверив рефлекс отведения лапы при щиплении задней подушечки лапы. Затем переложите животное на грелку (37 ° C) для поддержания температуры тела. Продолжайте вводить изофлуран (1%-2%; скорость потока 0,5 л/мин) через носовой конус.ПРИМЕЧАНИЕ ПО БЕЗОПАСНОСТИ: Для ограничения воздействия токсичного изофлурана на персонал рекомендуется использовать систему дозаторов, оснащенную фильтрующим блоком, для повторного улавливания циркулирующего изофлурана. Чтобы оптимизировать качество изображения, удалите волоски из уха с помощью тонкого триммера. Эту процедуру также можно провести за день или два до эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование крема для удаления волос не рекомендуется, так как известно, что он усугубляет воспалительную реакцию на коже мыши и приводит к артефактам визуализации. Положите животное на бок. С помощью хирургической ленты придерживайте край уха, и разровняйте его вдоль согревающей подушечки. Аккуратно наклейте ленту, чтобы не повредить ухо. Наполните шприц, оснащенный иглой 33 G, суспензией нейтрофилов (2-5 x 106 клеток на 20 мкл) и установите его на микроманипулятор.ПРИМЕЧАНИЕ: Угол инъекции между иглой и ухом на грелке должен составлять от 10° до 30°, чтобы свести к минимуму повреждение тканей и повысить успех инъекции клеток. Аккуратно переместите иглу (скосом вверх) к уху и медленно прокалывайте кожу. Как только игла окажется внутри кожи, медленно нажмите на поршень и введите 2-3 мкл клеточной суспензии.ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать областей с видимыми кровеносными сосудами, так как повреждение кровеносного сосуда приводит к нежелательному и сложному иммунному ответу на инъекцию и проблемам с визуализацией. Повторите инъекцию в 2-3 разных областях уха, желательно на расстоянии 2-3 мм друг от друга. Не стоит «переполнять» ухо клеточной суспензией.ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть выполнена в центр уха. Периферия уха тонкая и с ней нужно обращаться осторожно, так как ее можно легко повредить, в то время как центральная часть толще, содержит более крупные кровеносные сосуды и меньшее количество волосяных фолликулов, и может выдерживать большие объемы инъекций. Осторожно снимите хирургическую ленту и дайте животному прийти в сознание под присмотром. Дайте животному отдохнуть в течение 1 часа перед визуализацией, чтобы дать ткани и клеткам восстановиться после процедуры инъекции. 5. Анестезия при ЭКО ПРИМЕЧАНИЕ: Более глубокая анестезия значительно улучшает качество изображения, уменьшая артефакты движения, вызванные сердцебиением и дыханием. Мышей, которым вводили нейтрофилы, подвергают химической анестезии, которая обеспечивает более глубокий седативный эффект, чем газовая анестезия. Анестезия должна проводиться в соответствии с рекомендациями местного Комитета по уходу за животными и их использованию. Через час после восстановления после инъекции нейтрофилов обезболить животных подкожной инъекцией, содержащей смесь ксилазин/кетамин/ацепромазин (80 мг·кг-1, 2 мг·кг-1 и 4 мг·кг-1 соответственно) в физиологическом растворе.ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения воспроизводимости и надежности результатов животные должны находиться в тепле с момента введения анестезии до конца эксперимента с помощью грелки или циркуляционной прокладки для воды, подключенной к согревающему насосу. Для поддержания анестезии в течение 1 ч следует вводить смесь кетамина/ацепромазина (40 мг·кг-1 и 2 мг·кг-1 соответственно) подкожно каждые 40 минут. Периодически наблюдайте за мышами, находящимися под наркозом, на наличие признаков сознания, проверяя рефлекс отведения лапы. Кроме того, при процедурах визуализации продолжительностью более 1 часа нанесите на глаза стерильную немедикаментозную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии и поддерживать гидратацию тела путем подкожных инъекций физиологического раствора (200 мкл каждый час).ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, система на основе перфузии с цифровым управлением может быть использована для обеспечения периодического и плавного введения раствора для анестезии и/или подачи жидкости. Автоматический драйвер шприца может быть настроен на подачу желаемого объема анестетика и обеспечение гидратации в течение более длительного периода времени. С этой целью крылатая инфузионная игла может быть введена подкожно в спинную кожу животного и закреплена хирургической лентой. 6. Визуализация ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь конфигурация на животных и параметры визуализации оптимизированы для инвертированного многофотонного микроскопа, оснащенного одной лазерной линией для возбуждения и одновременного сбора излучений от различных флуорофоров. Перед тем, как поместить животное под наркозом на предметный столик для микроскопа, убедитесь, что микроскоп включен и что предметный столик и линзы предварительно нагреты до 37 °C. Закройте отверстие на сцене стеклянным покровным стеклом (толщина #1 или 1,5), которое совмещено с нагретой линзой. Осторожно переместите животное на сцену. Если визуализация планируется в течение длительного времени (>1 ч), нанесите офтальмологическую мазь и закрепите перфузионную систему на основе крылатой инфузии, как описано выше. Поместите каплю физиологического раствора в центр покровного стекла и поместите на него ухо, введенное нейтрофилами. Аккуратно прижмите ухо стерильной ватной палочкой по центру покровного стекла, чтобы удалить воздушные карманы.ПРИМЕЧАНИЕ: Применение физиологического раствора (или PBS) между ухом и покровным стеклом снижает преломление света из-за воздушных карманов, тем самым обеспечивая равномерный показатель преломления и превосходное качество изображения. Закрепите ухо, аккуратно прижав деревянную палочку (извлеченную из ватного тампона) к боковой стороне уха ближе к голове животного и зафиксировав ее с помощью ленты (рисунок 1А).ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепленная деревянная палочка сводит к минимуму артефакты движения из-за сердцебиения и дыхания и значительно повышает качество изображения. Важно отметить, что деревянная палка должна быть закреплена ровно настолько, чтобы стабилизировать ухо без нарушения кровотока. С помощью окуляра микроскопа найдите интересующую область, а затем переключитесь в режим многофотонной съемки. Установите длину волны лазерного возбуждения на 900-930 нм, чтобы обеспечить одновременный сбор GFP/зеленого флуоресцентного красителя, mTomato, а также коллагена-I (через ГВГ). Установите соответствующий набор зеркал и комбинацию фильтров на детекторах для сбора излучаемого света (полосовые фильтры: синий = 410-460 нм, зеленый = 495-540 нм, красный = 580-640 нм).Введенные нейтрофилы, помеченные зеленым флуоресцентным красителем, демонстрируют сильную зеленую флуоресценцию, что делает их видимыми под окуляром микроскопа, даже если они введены в более глубокие части уха. Определите параметр, наиболее подходящий для конфигурации оборудования. Даже если мигрирующие клетки можно отследить с интервалом от 30 с до 1 минуты, субклеточные события можно получить с более высокой скоростью (не менее <10 с). В приведенном ниже примере представлены две различные установки визуализации, чтобы показать разницу между классическим IVM и ISMic.В классическом подходе IVM для отслеживания миграции клеток и исследования ткани мыши-хозяина (рис. 1) используйте 30-кратный объектив и гальванический сканер с размером изображения 512 x 512 пикселей (размер пикселя 0,83 мкм), а также установите смещение по оси Z с помощью моторизованного предметного столика с шагом 2 мкм, что позволяет визуализировать объем глубиной 30 мкм каждые 30 с. В подходе ISMic к высокодинамическому ремоделированию мембран при более высоком увеличении и разрешении (рис. 2) используйте объектив с кратным увеличением и резонансный сканер с 3-кратным усреднением и размером изображения 512 x 512 пикселей (размер пикселя 0,25 мкм) и установите смещение по оси Z с помощью пьезо с шагом 1 мкм. Позволяет визуализировать объем глубиной 20 мкм каждые 4-5 с. Запускает миграцию нейтрофилов, вызывая стерильную лазерную травму. Сфокусируйте возбуждающий лазер на высокой мощности, достаточной для достижения не менее 80мВт22, на узком участке ткани (20 мкм х 20 мкм) в течение 10 с. Определите лазерную травму по сильным аутофлуоресцентным сигналам, появляющимся во всех каналах, и по результирующему изменению расположения коллагена (Рисунок 1D).ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения надежных результатов травма всегда должна быть индуцирована как можно дальше от кровеносных сосудов; В случае разрыва клетки крови, высвобождающиеся в ткани, повлияют на качество визуализации, а также приведут к сильной общей иммунной реакции. Сохраните данные в конце эксперимента для дальнейшего анализа. Усыпьте животное в соответствии с местными институциональными рекомендациями. При необходимости ткань может быть собрана для фиксации и дальнейшей обработки. 7. Репрезентативный анализ данных ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть визуализированы и проанализированы с помощью программного обеспечения микроскопа, программного обеспечения сторонних производителей или специализированных программ. Процедура и используемые инструменты зависят от конкретных потребностей исследователей. Здесь показан один из примеров рабочего процесса для количественной оценки кривизны мембраны и локальных изменений площади на переднем крае и в задней части мигрирующих нейтрофилов. Откройте файлы изображений с помощью Imaris или Fiji, чтобы визуализировать миграцию нейтрофилов в 4D и определить качество эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Компании Imaris и Fiji могут считывать формат изображений микроскопов нескольких марок. Обработайте данные с помощью следующих шагов, запустив настраиваемые скрипты кода MATLAB. Чтение выбранных файлов изображений с помощью пакета Bio-Formats28 для MATLAB. Сегментируйте каждый кадр 3D-объема с помощью алгоритмаОцу 29 для идентификации отдельных ячеек. Отслеживание идентифицированных объектов на основе минимального критерия смещения30. Определение активных контуров и границ объекта.Создание максимальной проекции для каждого объекта, идентифицированного на временном интервале. Примените функцию bwboundaries в MATLAB к max-проекции каждого идентифицированного объекта из шага 7.2 для создания 100 граничных точек. Оптимизируйте граничные точки, определенные с помощью алгоритма динамического контура, для достижения субпиксельной точности31 (рисунок 3A) с помощью функций пакета MATLAB, загруженного через http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. Наложите границы объекта и индекс траектории объекта, определенный трекингом на шаге 7.3, с максимальной проекцией исходного изображения для создания на выходе наложенного 2D-фильма для визуализации и ручной проверки. В наложенном видеоролике вручную выберите все объекты, определенные как перемещающиеся ячейки, исключив объекты, не являющиеся ячейками, соприкасающиеся с объектами и объекты с неполными границами. Запишите индексы отслеживания, начальные и конечные кадры траекторий каждой ячейки в электронную таблицу, которая будет использоваться в качестве входных данных для следующих шагов, реализуемых скриптами кода MATLAB. Отслеживайте точки границ ячеек от каждого кадра к следующему в соответствии с минимальным критерием смещения. Используйте функцию Polyarea в MATLAB для вычисления области, подчеркнутой соседними граничными точками на двух последовательных временных интервалах (рисунок 3C). Если локальная граница ячейки выходит за пределы ячейки, присвойте изменение области положительного знака. Если локальная граница ячейки перемещается внутрь ячейки, присвойте изменение области отрицательного знака. Измерьте локальную кривизну мембраны в каждой граничной точке для каждой рамы, подогнав соседние граничные точки к окружности (5 с каждой стороны; всего 11)32 (рис. 3B). Создавайте кимографы с помощью функции imagesc в MATLAB (рисунки 3D,E), чтобы показать изменения субклеточных особенностей с течением времени и соотнести их с положением клетки.