JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63581
, , ,
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research,National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,UNC-Chapel Hill

Summary

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Abstract

Dokularda bağışıklık hücresi alımı ve işlevi üzerine yapılan çalışmalar, son yirmi yılda çok aktif bir alan olmuştur. Nötrofiller, iltihaplanma bölgesine ulaşan ve enfeksiyon veya doku hasarı sırasında doğuştan gelen bağışıklık tepkisine katılan ilk bağışıklık hücreleri arasındadır. Şimdiye kadar, nötrofil göçü, tek tip stimülasyona veya agaroz veya mikro-akışkan kanallar altında sınırlı göçe dayalı çeşitli in vitro deneysel sistemler kullanılarak başarılı bir şekilde görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller, nötrofillerin in vivo olarak karşılaştığı karmaşık mikro ortamı özetlememektedir. İntravital hücre altı mikroskobu (ISMic) gibi çoklu foton mikroskobu (MPM) tabanlı tekniklerin geliştirilmesi, fizyolojik koşullar altında hücre altı çözünürlüklerde nötrofil dinamiklerini görselleştirmek ve araştırmak için benzersiz bir araç sunar. Özellikle, canlı anestezi uygulanmış bir farenin kulağı, erişilebilirlik kolaylığı ve cerrahi maruziyet eksikliği nedeniyle nötrofil interstisyel göçünü gerçek zamanlı olarak takip etmek için deneysel bir avantaj sağlar. ISMic, hem hücresel hem de daha da önemlisi hücre altı süreçleri zaman içinde 3D (4D) olarak izlemek için gerekli optik çözünürlüğü, hızı ve alım derinliğini sağlar. Ayrıca, interstisyel mikroçevrenin (yani, kan damarları, yerleşik hücreler, hücre dışı matris) çok modlu görüntülemesi, seçilmiş floresan belirteçleri eksprese eden transgenik farelerin, floresan problar aracılığıyla eksojen etiketlemenin, doku içsel floresansının ve ikinci/üçüncü harmonik üretilen sinyallerin bir kombinasyonu kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Bu protokol, 1) fare kulağına evlat edinen transfer için nötrofillerin hazırlanmasını, 2) optimal hücre altı görüntüleme için farklı ayarları, 3) fizyolojik bir yanıtı korurken hareket artefaktlarını en aza indirme stratejilerini, 4) ISMic kullanılarak nötrofillerde gözlemlenen zar yeniden şekillenme örneklerini ve 5) in vivo göç eden nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin kantitatif analizi için bir iş akışını açıklar.

Introduction

Yönlendirilmiş hücre göçü, gelişim, bağışıklık tepkisi, doku onarımı ve tümörün başlaması, ilerlemesi ve yayılması dahil olmak üzere farklı fizyolojik ve patolojik süreçler sırasında meydana gelen kritik bir olaydır 1,2. Bu işlem, plazma zarındaki akraba reseptörleri tarafından algılanan ve daha sonra karmaşık hücre içi sinyallere dönüştürülen spesifik hücre dışı kemotaktik sinyallere dayanır. Bu yollar, sırayla, hücre iskeletinin lokal aktivasyonu, zar kaçakçılığı ve yeniden şekillenmesi ve hücre polarizasyonu dahil olmak üzere bir dizi yanıt yoluyla hücre göçünü aktive eder3. İki farklı hücre göçü türü iyi karakterize edilmiştir: mezenkimal ve amip4. Mezenkimal göç nispeten yavaştır (10 μm/dak) ve ECM’de gezinmek için zayıf yapışmalar kullanır. Modaliteden bağımsız olarak, hücre göçü, plazma zarının sürekli olarak yeniden şekillenmesini gerektirir, bu da hücrelerin ön kenarında çıkıntılı yapıların oluşmasına neden olur ve bu, arkadaki zarın geri çekilmesi ile sıkı bir şekilde koordine edilir1.

Bu hücre altı süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları çözmek için, göç eden hücrelerdeki zarların dinamiklerini uygun bir zamansal ve mekansal çözünürlükte görselleştirmek esastır. Ayrıca, zarın yeniden şekillenmesi, göç eden hücreleri çevreleyen doku mikro ortamının özelliklerinden güçlü bir şekilde etkilendiğinden, bu süreci doğrudan doğal dokuda, canlı hayvanlarda görüntülemek çok önemlidir. Bu, intravital mikroskopi (IVM) kullanılarak gerçekleştirilir5. İlk IVM görüntüleme, ~ 200 yıl önce, lökosit ekstravazasyonunun basit bir trans-aydınlatma mikroskobu6 kullanılarak görselleştirildiği ve daha sonra IVM’nin esas olarak Zebra Balığı ve Drosophila 7,8 gibi yarı saydam model organizmalar üzerinde kullanıldığı zaman gerçekleştirildi. Son yirmi yılda, IVM farelerde, sıçanlarda ve domuzlar gibi daha büyük memelilerde hücresel süreçleri araştırmak için başarıyla kullanılmıştır 5,9. Bu, 1) konfokal ve çoklu foton (MP) mikroskobundaki önemli gelişmeler ve 2) floresan etiketli proteinleri ve raportörleri ifade etmek için çeşitli hayvan modellerinin hızlı mühendisliğine izin veren CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisinin artması nedeniyle mümkün olmuştur. Ayrıca, tümör başlangıcı, hücre göçü ve bağışıklık tepkisi gibi süreçler sırasında tek tek hücrelerin ve mikro çevrelerinin görselleştirilmesi, damar sistemini etiketlemek için boyaların sistemik olarak eklenmesi gibi diğer dışsal etiketleme biçimleriylemümkün olmuştur 10,11 ve İkinci Harmonik Nesil (SHG)10 yoluyla kollajen gibi endojen moleküllerin uyarılması, 12 ve Üçüncü Harmonik Nesil (THG) yoluyla sinir lifleri11,13. Son olarak, kalp atışı ve solunuma bağlı hareket artefaktlarını en aza indirmek için tekniklerde bir gelişme, araştırmacıların canlı hayvanlarda gözlemlenenlere benzer bir çözünürlük düzeyinde birkaç hücre altı olayı doğrudan görüntülemesine ve araştırmasına olanak tanıyan intravital hücre altı mikroskopinin (ISMic) geliştirilmesine yol açmıştır in vitro 14,15,16,17 . ISMic örnekleri arasında ekzositoz 14,15,16,17 ve endositoz15 sırasında hücre iskeleti dinamiklerinin araştırılması, hücre göçü17,18 sırasında hücre iskeleti dinamik yeniden şekillenmesi, mitokondriyal lokalizasyon ve metabolizma 19,20 ve beyinde kalsiyum sinyalizasyonu21 yer alır.

Bu protokol, ISMic kullanan canlı bir farenin kulak derisinde nötrofil göçü sırasında hücre altı çözünürlükte hücre zarının yeniden şekillenmesini araştırmak için farklı adımları ve prosedürleri detaylandırır. Bu yaklaşım, daha önce açıklananprotokoller 22,23’e dayanmaktadır ve daha yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük elde etmek için uyarlanmıştır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri Ulusal Kanser Enstitüsü (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokoller LCMB-031 ve LCMB-035) tarafından onaylanmıştır ve ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur. Deneyler için 2 ila 6 aylık hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. mT/mG ve vahşi tip (WT) konakçı fareler bir FVB/NJ arka planındayken, LyzM-Cre x mTmG fareleri bir C57BL/6 arka planındadır. 1. Reaktiflerin ve aletlerin malzemeleri ve hazırlanması Tüpleri, tabakları ve iğneleri/şırıngaları gece boyunca PBS +% 1 BSA (Kalsiyum ve Magnezyum olmadan) ile çalkalama altında kaplayın. Hayvan işleri için kullanılacak yüzeyleri ve aletleri/aletleri etanol kullanarak veya otoklavlama ile dikkatlice temizleyin.Nötrofillerin saflaştırılması için aşağıdakileri hazırlayın: 3 x 15 mL tüp, 1 x 60 mm tabak, 1 x 1.5 mL tüp; 10 mM HEPES (pH 7.3) içeren HBSS; kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (ACK); Histopak 1077; ve Histopaque 1119. Nötrofil enjeksiyonları için aşağıdakileri hazırlayın: 1 x düşük hacimli şırınga (10 μL), 1 x 33 G eğimli iğne, izofluran ve anestezi solüsyonu (Ketamin, Ksilazin ve Asepromazin, sırasıyla 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 ve 4 mg·kg-1, salin çözeltisinde). 2. Bir donör fareden nötrofillerin saflaştırılması Donör fareyi yerel kurumsal düzenlemelere göre ötenazi yapın. Hayvandan (femur, tibia ve humerus) uzun kemikler toplayın, kemik bütünlüğünü korumaya dikkat edin ve toplama sırasında kemiklerin başlarını kesmekten kaçının24. BSA kaplı 60 mm’lik bir tabakta kasları ve yağ dokusunu çıkarın. İliğe erişmek için kemiklerin başlarını kesin ve ardından HBSS ile doldurulmuş bir şırınga (27 G iğne) kullanarak kemik iliğini yıkayın ve homojenize edin. Çözeltiyi 40 μm’lik bir süzgeç kullanarak 15 mL BSA kaplı bir tüpe süzün ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, kırmızı kan hücrelerini parçalamak için peleti 1 mL ACK’da 30 saniye boyunca yeniden süspanse edin ve ardından lizizi durdurmak için 9 mL HBSS ekleyin. Çözeltiyi RT’de 5 dakika boyunca 400 x g’da santrifüjleyin. Tüpün altına 4 mL 1119 Histopak’ı nazikçe yerleştirerek ve ardından üstüne 4 mL 1077 Histopak’ı nazikçe katmanlayarak 15 mL BSA kaplı bir tüpte bir yoğunluk adım gradyanı hazırlayın. İki katmanı karıştırmamak için ekstra özen gösterin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 2 mL HBSS’de yeniden süspanse edin. Çözeltiyi, yukarıda hazırlanan adım gradyanının üzerine nazikçe katmanlayın. Mümkün olan en düşük hızlanma ve yavaşlama hızıyla RT’de 30 dakika boyunca 1.000 x g’da dönün (“fren yok” tercih edilir). Tüpün üst kısmından 1077 Histopak tabakasının yarısını nazikçe aspire edin. 1077 Histopak katmanın kalan yarısını ve 1119 Histopak katmanın üst yarısını yeni BSA kaplı bir tüpte toplayın. İki yoğunluk katmanı arasındaki bulutlu hücre süspansiyonu ağırlıklı olarak nötrofiller içerir. 15 mL’lik nihai hacme ulaşmak için HBSS ekleyin ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. RT’de 5 dakika boyunca 400 x g’da döndürün. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 10 mL HBSS ile yeniden süspanse edin ve yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g’da döndürün. Prosedürü tekrarlayın ve ardından bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirlemek için peleti 15 mL HBSS’de yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri 1 mL HBSS’de döndürün ve yeniden süspanse edin ve 1.5 mL BSA kaplı bir tüpe aktarın. Saflaştırmadan sonra, nötrofil süspansiyonunu BSA kaplı tüpte, etiketleme ve / veya enjeksiyona kadar RT’de bir tüp döndürücü üzerinde 30 dakika boyunca hafif çalkalama altında tutun.NOT: Başarılı bir saflaştırma, fare başına saflıkta 10-20 x 106 nötrofil verir. Saflık, daha önce tarif edilen nötrofil belirteçleri (Ly6G +, Ly6C-, Gr1 + ve CD11b +) kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirilir25,26.NOT: İnsan periferik kanından ve fare kemik iliğinden nötrofil saflaştırmasına ilişkin protokoller daha önce mevcuttur24,27. 3. Nötrofil etiketleme NOT: Nötrofilleri görselleştirmek için, miyeloid hücrelerin GFP ile kaynaşmış zar hedefli bir peptidi eksprese ettiği LyzM-Cre mT / mG farelerinden saflaştırıldılar. Ek olarak, vahşi tip (WT) farelerden saflaştırılmış nötrofiller in vitro olarak etiketlendi. Aşağıdaki adımlar, saflaştırılmış nötrofilleri ticari hücre geçirgen yeşil floresan boya ile etiketlemek için kullanılan prosedürü açıklar ve tercih edilen diğer herhangi bir MPM uyumlu floresan probuna uyarlanabilir. Yeşil floresan boyayı (üreticinin tavsiye ettiği konsantrasyon; burada 1 μM) 1.5 mL BSA kaplı bir tüpte nötrofil süspansiyonuna (WT fareden saflaştırılmış) ekleyin. Bir tüp döndürücüde hafif çalkalama altında RT’de 30 dakika inkübe edin. HBSS kullanarak üç kez yıkayın, RT’de 5 dakika boyunca 400 x g’da döndürün ve peleti 1 mL HBSS’de yeniden süspanse edin. Nötrofil süspansiyonunu, enjeksiyon prosedürüne kadar RT’de bir tüp döndürücüde hafif çalkalama altında BSA kaplı tüpte tutun.NOT: Etiketlemeden hemen sonra gerçekleştirilen etiketli nötrofillerin enjeksiyonu çok tercih edilir. Bununla birlikte, gerekirse, etiketli nötrofiller, in vivo nötrofil yanıtının bütünlüğünden ödün vermeden etiketlemeden sonra 10-15 dakika daha ajitasyon altında tutulabilir. Uzun süreli ajitasyon (etiketlemeden 60 dakikadan fazla sonra) topaklanmaya, nötrofil ölümüne ve in vivo yanıltıcı gözlemlere yol açacaktır. Enjeksiyondan hemen önce, 20 μL’de 2-5 x 106 hücre yoğunluğuna ulaşmak için hücre peletini tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. 4. Nötrofil enjeksiyonu NOT: Anestezi, yerel kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre yapılmalıdır. Hayvanı kapalı bir odaya yerleştirin ve bir oksijen konsantratörüne bağlı kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı kullanarak %3-5 izofluran (2 L/dk akış hızı) uygulayın. Arka ayak pedini sıkıştırdıktan sonra pençe çekme refleksini test ederek hayvanın bilinçsiz olup olmadığını değerlendirin. Ardından, vücut ısısını korumak için hayvanı bir ısıtma pedine (37 ° C) aktarın. İzofluranı (% 1 -% 2; akış hızı 0.5 L / dak) bir burun konisinden uygulamaya devam edin.GÜVENLİK NOTU: Personelin toksik izoflura maruz kalmasını sınırlamak için, dolaşımdaki izofluranı yeniden yakalamak için bir filtreleme ünitesi ile donatılmış bir dağıtıcı sisteminin kullanılması önerilir. Görüntüleme kalitesini optimize etmek için, ince bir düzeltici kullanarak kulaktaki tüyleri alın. Bu prosedür deneyden bir veya iki gün önce de gerçekleştirilebilir.NOT: Fare derisindeki enflamatuar yanıtı şiddetlendirdiği ve görüntüleme artefaktları oluşturduğu bilindiği için tüy dökücü kremin kullanılması önerilmez. Hayvanı yan yatırın. Cerrahi bant kullanarak kulağın kenarını tutun ve ısıtma pedi boyunca düzleştirin. Kulağa herhangi bir zarar gelmesini önlemek için bandı nazikçe uygulayın. 33 G’lik bir iğne ile donatılmış bir şırıngayı nötrofil süspansiyonu (20 μL’de 2-5 x10, 6 hücre) ile doldurun ve bir mikromanipülatöre monte edin.NOT: Doku hasarını en aza indirmek ve hücre enjeksiyonunun başarısını artırmak için bir ısıtma pedi üzerindeki iğne ile kulak arasındaki enjeksiyon açısı 10° ile 30° arasında olmalıdır. İğneyi (eğim yukarı bakacak şekilde) yavaşça kulağa doğru hareket ettirin ve cildi yavaşça delin. İğne cildin içine girdikten sonra, pistonu yavaşça itin ve 2-3 μL hücre süspansiyonu verin.NOT: Bir kan damarına zarar vermek, enjeksiyona karşı istenmeyen ve karmaşık bir bağışıklık tepkisine ve görüntüleme ile ilgili sorunlara yol açtığından, görünür kan damarları olan alanlardan kaçınılmalıdır. Enjeksiyonu kulağın 2-3 farklı bölgesinde, tercihen 2-3 mm aralıklarla tekrarlayın. Kulağı hücre süspansiyonu ile “aşırı doldurmayın”.NOT: Enjeksiyon kulağın merkezinde yapılmalıdır. Kulağın çevresi incedir ve kolayca zarar görebileceği için dikkatli kullanılmalıdır, oysa orta kısım daha büyük kan damarları ve daha az saç kökü içeren daha kalındır ve daha büyük enjeksiyon hacimlerine dayanabilir. Cerrahi bandı dikkatlice çıkarın ve hayvanın gözetim altında bilincini geri kazanmasına izin verin. Doku ve hücrelerin enjeksiyon prosedüründen sonra iyileşmesine izin vermek için görüntülemeden önce hayvanın 1 saat dinlenmesine izin verin. 5. IVM için Anestezi NOT: Daha derin bir anestezi, kalp atışı ve solunuma bağlı hareket artefaktlarını azaltarak görüntüleme kalitesini önemli ölçüde artırır. Nötrofil enjekte edilen fareler, gazla indüklenen anesteziden daha derin sedasyon sağlayan kimyasal anesteziye tabi tutulur. Anestezi, yerel kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre yapılmalıdır. Nötrofil enjeksiyonundan geri kazanımdan bir saat sonra, salin solüsyonunda bir Xylazine / Ketamin / Asepromazin (sırasıyla 80 mg · kg-1, 2 mg · kg-1 ve 4 mg · kg-1) karışımı içeren deri altı enjeksiyonu ile hayvanları uyuşturun.NOT: Sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için, hayvanlar anestezi zamanından deneyin sonuna kadar bir ısıtma pompasına bağlı bir ısıtma yastığı veya su sirkülasyon pedi kullanılarak sıcak tutulmalıdır. Anesteziyi 1 saatten fazla sürdürmek için, her 40 dakikada bir deri altına Ketamin / Asepromazin (sırasıyla 40 mg · kg-1 ve 2 mg · kg-1 ) karışımı enjekte edin. Pençe çekme refleksini test ederek anestezi uygulanmış fareleri bilinç belirtileri açısından periyodik olarak izleyin. Ek olarak, 1 saatten fazla süren görüntüleme prosedürleri için, anestezi sırasında kornea kurumasını önlemek için gözlere steril, ilaçsız bir oftalmik merhem uygulayın ve deri altı salin solüsyonu enjeksiyonları (her saat 200 μL) ile vücut hidrasyonunu koruyun.NOT: Alternatif olarak, anestezi solüsyonunun periyodik ve düzgün bir şekilde enjekte edilmesini sağlamak ve/veya sıvı sağlamak için dijital olarak kontrol edilen perfüzyon bazlı bir sistem kullanılabilir. İstenilen anestezi hacmini sağlamak ve daha uzun süreler boyunca hidrasyon sağlamak için otomatik bir şırınga sürücüsü ayarlanabilir. Bu amaçla, kanatlı bir infüzyon iğnesi hayvanın sırt derisine deri altından sokulabilir ve cerrahi bantla sabitlenebilir. 6. Görüntüleme NOT: Hayvan kurulumu ve burada açıklanan görüntüleme parametreleri, farklı floroforlardan gelen emisyonları uyarmak ve aynı anda toplamak için tek bir lazer çizgisi ile donatılmış ters çevrilmiş bir çoklu foton mikroskobu için optimize edilmiştir. Anestezi uygulanmış hayvanı mikroskop aşamasına yerleştirmeden önce, mikroskobun açık olduğundan ve hem sahnenin hem de lenslerin 37 °C’ye önceden ısıtıldığından emin olun. Sahnedeki deliği, ısıtılmış lensle hizalanmış bir cam lamel (kalınlık #1 veya 1.5) ile kapatın. Hayvanı dikkatlice sahneye taşıyın. Görüntüleme uzun bir süre (>1 saat) planlanıyorsa, oftalmik merhem uygulayın ve kanatlı infüzyon bazlı perfüzyon sistemini yukarıda tarif edildiği gibi sabitleyin. Lamelin ortasına bir damla salin damlatın ve nötrofil enjekte edilen kulağı üzerine yerleştirin. Hava ceplerini çıkarmak için lamel ortası boyunca steril bir pamuklu çubuk kullanarak kulağı nazikçe düzleştirin.NOT: Kulak ve lamel arasına salin (veya PBS) uygulanması, hava ceplerinden kaynaklanan ışık kırılmasını azaltır, böylece eşit kırılma indisi ve üstün görüntüleme kalitesi sağlar. Kulağın hayvanın kafasına daha yakın olan tarafına tahta bir çubuğu (pamuklu çubuktan çıkarılmış) hafifçe bastırarak ve bantla kilitleyerek kulağı sabitleyin (Şekil 1A).NOT: Güvenli bir tahta çubuk, kalp atışı ve solunumdan kaynaklanan hareket artefaktlarını en aza indirir ve görüntüleme kalitesini önemli ölçüde artırır. Daha da önemlisi, tahta çubuk, kan akışını bozmadan kulağı stabilize edecek kadar sabitlenmelidir. Mikroskop merceğini kullanarak bir ilgi alanı bulun ve ardından çoklu foton toplama moduna geçin. Lazer uyarma dalga boyunu 900-930 nm’ye ayarlayın ve GFP/yeşil floresan boya, mTomato ve kollajen-I’in (SHG aracılığıyla ) aynı anda elde edilmesini sağlayın. Yayılan ışığı toplamak için dedektörlerde uygun ayna setini ve filtre kombinasyonunu ayarlayın (bant geçiren filtreler: Mavi = 410-460 nm, Yeşil = 495-540 nm, Kırmızı = 580-640 nm).NOT: Enjekte edilen nötrofiller, yeşil floresan bir boya ile etiketlendiğinde, kulağın daha derin kısımlarına enjekte edilseler bile mikroskop göz merceği altında görünür olmalarını sağlayan güçlü bir yeşil floresan sergiler. Donanım yapılandırmasına en uygun ayarı belirleyin. Göç eden hücreler 30 saniye ila 1 dakikalık aralıklarla izlenebilse bile, hücre altı olayları daha yüksek bir hızda (en az <10 saniye aralıkla) görüntüleyin. Aşağıdaki örnekte, klasik IVM ve ISMic arasındaki farkı göstermek için iki farklı görüntüleme kurulumu sunulmuştur.Hücre göçünü izlemek ve konakçı fare dokusunu araştırmak için klasik IVM yaklaşımında (Şekil 1), 30x lens ve 512 x 512 piksel görüntü boyutuna (0,83 μm piksel boyutu) sahip bir galvo tarayıcı kullanın ve her 30 saniyede bir 30 μm derinliğinde bir hacmin görüntülenmesine izin veren 2 μm’lik bir adım boyutuna sahip motorlu aşamayı kullanarak z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın. Daha yüksek büyütme ve çözünürlükte yüksek dinamik membran yeniden modellemesine yönelik ISMic yaklaşımında (Şekil 2), 40x lens ve 3x ortalamaya ve 512 x 512 piksel görüntü boyutuna (0,25 μm piksel boyutu) sahip bir rezonans tarayıcı kullanın ve 1 μm adım boyutuna sahip bir piezo kullanarak z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın, Her 4-5 saniyede bir 20 μm derinliğinde görüntülemeye izin verir. Steril bir lazer yaralanmasına neden olarak nötrofil göçünü tetikleyin. Uyarma lazerini en az 80 mW’a ulaşacak kadar yüksek bir güçte22, dokunun dar bir alanına (20 μm x 20 μm) 10 saniye boyunca odaklayın. Lazerin neden olduğu yaralanmayı, tüm kanallarda görünen güçlü otomatik floresan sinyalleri ve bunun sonucunda ortaya çıkan kollajen düzenlemesindeki değişiklik ile tanımlayın (Şekil 1D).NOT: Güvenilir sonuçlar elde etmek için, yaralanma her zaman kan damarlarından mümkün olduğunca uzağa indüklenmelidir; Yırtılırsa, dokuya salınan kan hücreleri görüntüleme kalitesini etkileyecek ve güçlü bir genel bağışıklık reaksiyonu ile sonuçlanacaktır. Daha fazla analiz için deneyin sonunda verileri kaydedin. Hayvanı yerel kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın. Gerekirse, fiksasyon ve daha ileri işlemler için doku toplanabilir. 7. Temsili veri analizi NOT: Veriler, mikroskop yazılımı, üçüncü taraf yazılım veya özelleştirilmiş programlarla görselleştirilebilir ve analiz edilebilir. Prosedür ve kullanılan araçlar, araştırmacıların özel ihtiyaçlarına bağlıdır. Burada, göç eden nötrofillerin ön kenarındaki ve arkasındaki membran eğriliğini ve yerel alan değişikliklerini ölçmek için bir iş akışı örneği gösterilmektedir. Nötrofillerin göçünü 4D olarak görselleştirmek ve deneyin kalitesini belirlemek için görüntüleme dosyalarını Imaris veya Fiji ile açın.NOT: Imaris ve Fiji, çeşitli mikroskop markalarının görüntüleme formatını okuyabilir. Özelleştirilmiş MATLAB kod komut dosyalarını çalıştırarak verileri aşağıdaki adımlarla işleyin. Seçilen görüntüleme dosyalarını MATLAB için Bio-Formats28 paketiyle okuyun. Tek tek hücreleri tanımlamak için 3B cildin her karesini Otsu algoritması29 ile bölümlere ayırın. Tanımlanan nesneleri minimum yer değiştirme kriteri30’a göre takip edin. Nesnenin aktif konturlarını ve sınırlarını belirleyin.Bir zaman diliminde tanımlanan her nesne için bir maksimum projeksiyon oluşturun. 100 sınır noktası oluşturmak için MATLAB’daki bwboundaries işlevini, adım 7.2’den itibaren tanımlanan her nesnenin maksimum projeksiyonuna uygulayın. http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/ aracılığıyla indirilen MATLAB paketindeki işlevleri kullanarak alt piksel hassasiyetini31 (Şekil 3A) elde etmek için dinamik kontur algoritmasıyla tanımlanan sınır noktalarını optimize edin. Görselleştirme ve manuel kontrol için 2B kaplamalı bir filmin çıktısını oluşturmak için adım 7.3’teki izleme tarafından belirlenen nesnenin sınırlarını ve nesne yörünge indeksini orijinal görüntünün maksimum projeksiyonu ile kaplayın. Kaplanmış filmde, hücre olmayan nesneleri, dokunan nesneleri ve tamamlanmamış sınırları olan nesneleri dışlayarak, geçiş hücreleri olarak tanımlanan tüm nesneleri el ile seçin. MATLAB kod komut dosyaları tarafından uygulanan aşağıdaki adımlar için girdi olarak kullanılacak bir elektronik tabloya her hücre yörüngesinin izleme indekslerini, başlangıç ve bitiş çerçevelerini kaydedin. Minimum öteleme kriterine göre her kareden bir sonrakine kadar hücre sınır noktalarını izleyin. Ardışık iki zaman diliminde bitişik sınır noktalarının altını çizdiği alanı hesaplamak için MATLAB’daki Çoklu Alan işlevini kullanın (Şekil 3C). Yerel hücre sınırı hücreden dışarı doğru hareket ederse, alan değişikliğine pozitif bir işaret atayın. Yerel hücre sınırı hücrenin içine doğru hareket ederse, alan değişikliğine negatif bir işaret atayın. Komşu sınır noktalarını bir daireye (her tarafta 5; toplam 11)32 uydurarak her çerçeve için her sınır noktasındaki yerel membran eğriliğini ölçün (Şekil 3B). Hücre altı özelliklerin zaman içindeki değişimlerini göstermek ve hücrenin konumuyla ilişki kurmak için MATLAB’daki (Şekil 3D,E) imagec işlevini kullanarak kimograflar oluşturun.

Representative Results

Burada, sırasıyla hücresel ve hücre altı çözünürlük sağlayan klasik IVM ve ISMic’i göstermek için iki farklı sonuç seti sunulmuştur. İlk örnekte, nötrofiller vahşi tip (WT) bir fareden saflaştırıldı, sitoplazmayı boyamak için Cell Tracker Green ile etiketlendi ve plazma zarını hedefleyen bir floresan proteini eksprese eden transgenik bir fareye enjekte edildi (mTomato faresi, mT / mG33 olarak da bilinir, Şekil 1 ve Film 1 ve Film 2). Bu alıcı fare, IVM tabanlı yaklaşımla (adım 6.8.1) kan damarları, yerleşik hücreler ve saç folikülleri gibi kulak dokusundaki yapısal özelliklerin görselleştirilmesini sağladı (Şekil 1C ve Film 1). SHG (uyarma dalga boyunun yarısında tespit edilen) yoluyla ortaya çıkan kollajen lifleri, nötrofillerin enjekte edildiği dermiste karmaşık bir ağda düzenlendi. Saç foliküllerinin (HF) kenarı boyunca, bir epitel hücresi tabakası (yani keratinositler) gözlendi. Bazen, deride lokal bir çöküntü ile sonuçlanan kalıntı kıllardan elde edilen artefaktlar görselleştirildi (H). Lazer kaynaklı yaralanmalar, tüm kanallarda tespit edilen güçlü oto-floresansları ve kollajen düzenlemesindeki değişiklikler sayesinde kolayca görüntülenebildi (Şekil 1D). Derinin 3B mimarisinin ve enjekte edilen nötrofillerin lokalizasyonunun daha eksiksiz bir görünümü, derinin dış katmanlardan iç katmanlara kadar bir Z yığınını ve bir 3B hacim oluşturmayı tasvir eden Film 1’de takdir edilebilir. Hızlandırılmış görüntüleme, nötrofillerin kulak derisini örneklediğini ve ECM ve konak doku ile etkileşime girdiğini gösterdi (Film 2). Bu çözünürlükte görüntüleme ve her 30 saniyede bir Z yığını elde etmek, hücre izlemenin gerçekleştirilmesine ve hareketlilik parametrelerinin (yani hız ve yönlülük) ölçülmesine izin verir, ancak bu çözünürlükte membran yeniden şekillenmesinin kesin ve ayrıntılı bir analizi zordur. İkinci örnekte, membranın yeniden şekillenmesi, LyzM-cre mT / mG farelerinden saflaştırılan ve WT hayvanlarına enjekte edilen mGFP eksprese eden nötrofiller kullanılarak ISMic yaklaşımı (adım 6.8.2) yoluyla değerlendirildi (Şekil 2A, deneysel akış şeması). ISMic protokolü kullanılarak (Şekil 2B’deki Film 3 ve hareketsiz görüntüler) ve lazer yaralanması üzerine, göç sırasında plazma zarının dinamik yeniden şekillenmesi gözlenir ve ön kenarda zar çıkıntılarının oluşumu ve hücrelerin arkasının geri çekilmesi açıkça görüntülenir (Şekil 2 ve Film 3). Film 3’te vurgulanan zaman atlamalı sekanslar, ECM ile etkileşimlerin karmaşıklığını ortaya çıkarır. Gerçekten de, nötrofiller ya lifler boyunca ya da aralarındaki boşluklarda hareket eden interstisyel boşluktan göç etti. Son olarak, eğrilikteki değişiklikler ve hücrelerin önündeki ve arkasındaki alan değişiklikleri gibi nicel yönler her bir zaman noktası için niceliksel olarak ölçüldü. Örnek olarak Şekil 2B’de açıklanan hücre kullanılarak, plazma zarının yerel dinamikleri, hücre yüzeyinin altında yatan 100 sınır noktasının tanımlanmasına dayanan bir algoritma boru hattı (bkz. adım 7) kullanılarak analiz edildi (Şekil 3A). Lokal eğrilikteki (Şekil 3B) ve plazma zarı çıkıntılarının altını çizdiği alandaki (Şekil 3C) değişiklikler her bir sınır noktası için hesaplanmış ve her bir zaman dilimi için kimografi olarak rapor edilmiştir (Şekil 3D,E). Hücrelerin hem önü hem de arkası, hücrelerin yan tarafına göre daha yüksek eğriliği korur (Şekil 3D); negatif alan değişiklikleri (geri çekilmeler, mavi bölgeler), hücrelerin arkasında, pozitif alan değişikliklerinin daha belirgin olduğu ön kenara göre daha belirgindir (çıkıntılar, kırmızı bölgeler) (Şekil 3E). Şekil 1: Fare kulağı derisindeki nötrofillerin IVM’si. (A) Mikroskop sahnesinde kulak kurulumunun şematik çizimi. (B) Deneysel akış şeması. (C) Farklı çıkıntılara sahip, floresan etiketli nötrofiller enjekte edilmiş bir mTomato faresinin kulak derisinin temsili görüntüsü. Saç folikülü (HF), Kan Damarı (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Bazal Hücre Tabakası (BCL) ve Saç artefaktı (cilt yüzeyinde kalan kıl nedeniyle, H). (D) Steril lazer yaralanmasından sonra fare derisinin temsili görüntüsü: mavi kanal (sağda), yeşil ve kırmızı kanallar (ortada), birleştirilmiş görüntü (solda). Görüntünün sol tarafında, hem yeşil hem de kırmızı kanallarda güçlü bir otofloresan emisyonunun yanı sıra kollajen-I liflerinde bir delik oluşumuyla gözlemlenen ECM’nin bozulması nedeniyle yaralanma görülebilir. C ve D’de Yeşil: nötrofiller; Kırmızı: fare konak dokusu; Camgöbeği: Kollajen-I SHG. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Bir WT fare kulağında göç eden mGFP nötrofilinin hızlandırılmış çekimi. (A) Deneysel akış şeması. (B) Film 3’ten temsili hareketsiz görüntüler. (C) Membran 3D organizasyonunu görselleştirmek için aynı hücrenin hacim oluşturması. Yüksek zar dinamiği alanı bir okla gösterilir (geri çekme için kırmızı ve çıkıntı için mavi). (D) İşlenen hücre hacminin yakın çekim ve eğik görselleştirmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: ISMic kullanılarak toplanan membran dinamiğinin nicelleştirilmesi için analiz hattı. (A) Şekil 2B’de açıklanan mGFP nötrofil için iki ardışık çerçeve arasında hücre konturu belirleme ve sınır noktalarının yeniden bölünmesi (100 sınır noktası). (B) Renkli sınırlar, her sınır noktası için belirlenen yerel zar eğriliğini temsil eder. (C) Yerel alan, iki ardışık çerçeve arasındaki değişiklikler (geçerli: mavi ve sonraki: kırmızı). Yeşil alanlar, yerel membran hareketinin izleme sonuçlarını temsil eder. Sarı oklar, zar yer değiştirmesinin genel yönünü gösterir. (D) Hücrenin zaman içindeki sınır eğriliği kimografisi. Dikey eksen, 1 ve 100’ün göç yönüne göre hücrenin arkasını temsil ettiği sınır noktaları indekslerini temsil eder. (E) Zaman içinde hücrenin zar çıkıntısını (kırmızı) ve zar geri çekilmesini (mavi) yansıtan lokal alan değişikliği kimografisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Film 1: IVM kullanılarak bir mTomato fare kulağında görselleştirilen yeşil etiketli nötrofiller. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: nötrofil. Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın. Film 2: Bir mTomato fare kulak derisinde göç eden nötrofillerin IVM’si. Videolar, 5 kare/sn kare hızıyla ͂27 dakika boyunca elde edilen bir görüntü yığınının maksimum yoğunluktaki projeksiyonlarıdır. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: nötrofil. Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın. Film 3: Bir WT fare kulağında nötrofil göçü sırasında zar yeniden şekillenmesinin ISMic’i. Videolar, 10 kare/sn kare hızıyla ͂8 dakika boyunca elde edilen bir görüntü yığınının maksimum yoğunluktaki projeksiyonlarıdır. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: mGFP nötrofil; Açık yeşil: işlenmiş nötrofil. Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hücre göçü ve zarın yeniden şekillenmesi alanındaki onlarca yıllık ilerlemelere rağmen, çok az sayıda çalışma canlı hayvanlarda hücre altı özellikleri görselleştirmek için IVM’yi kullanmıştır. Bu protokolde açıklanan prosedürler, canlı hayvanlarda nötrofil göçü ve daha spesifik olarak bu işlem sırasında plazma zarının yeniden şekillenmesi hakkında yeni bilgiler edinmek için güçlü bir araç sağlar. Bu yaklaşım, doku mikro çevresinin doğal karmaşıklığını göz önünde bulundurarak fizyolojik koşullar altında nötrofil göçünü araştırmayı mümkün kılar. Gerçekten de, MPM kullanımı, seçilen floresan belirteçleri ifade eden fare suşlarının, eksojen doku etiketlemesinin, endojen floresansın uyarılmasının ve SHG veya THG12,13 yoluyla üretilen sinyallerin bir kombinasyonunu kullanarak konakçı doku içindeki çoklu özelliklerin görselleştirilmesini sağlar.

Bu prosedürde dikkate alınması gereken olası bir konu fotohasardır. MPM, fotobleaching ve fototoksisite açısından genellikle konfokal mikroskopiden daha güvenli olsa da, canlı dokuları görüntülerken dikkatli olunmalıdır34. Fototoksisite, küçük parlak beneklerden daha büyük hasarlı doku alanlarına kadar değişen görüntüleme artefaktları oluşturarak veya çeşitli hücre içi yolları inhibe ederek/uyararak sonuçları büyük ölçüde engelleyebilir. Fototoksisiteyi önlemek için, lazer gücü minimumda tutulmalı ve fizyolojik koşulların korunduğunu doğrulamak için uygun kontroller tasarlanmalıdır (örneğin, kan akışının ölçülmesi, oksidatif stres probları)35,36. Ayrıca, cildi içeren bu özel prosedürde, koyu tüylü hayvanlarda bulunan melanin fototoksisiteye daha duyarlı olduğu için albino suşları şiddetle tavsiye edilir 36,37,38.

Prosedürün ana sınırlamaları arasında kullanılan mikroskop sistemi ve nötrofillerin doğası yer almaktadır. MPM kullanımı, diğer ışık mikroskobu teknikleriyle (örneğin, konfokal, eğirme diski) karşılaştırıldığında doku görüntüleme derinliğini önemli ölçüde artırsa da, kulaktaki hücre altı dinamikleri görselleştirme yeteneği dokunun en dış katmanlarıyla (80-100 μm) sınırlıdır. Bunun nedeni, kalın ECM katmanı tarafından üretilen yoğun ışık saçılımının daha derin katmanlardaki göçü araştırmayı zorlaştırmasıdır. Diğer bir sınırlama, nötrofillerin çok kısa ömürlü olması ve gen düzenleme tekniklerini gerçekleştirmek için yeterince uzun süre kültürde tutulamamasıdır. Bu, belirli genlerden yoksun nötrofiller üretmek veya seçilmiş mutasyonları barındırmak için mühendislik fareleri tarafından aşılabilir, bu da elbette araştırma maliyetlerini ve süresini artırır.

Burada açıklanan prosedürler, zar dinamiklerini araştırmak için tasarlanmış olmasına rağmen, sadece nötrofillerde değil, aynı zamanda diğer bağışıklık hücresi tiplerinde ve göçmen hücrelerde de herhangi bir hücre biyolojik sorusunu ele almak için uyarlanabilir. Hücresel davranışlar (örneğin, göç fenotipi, hücre hızı ve yönlülük22) hakkında düşük büyütmeli IVM yoluyla toplanan bilgiler, organellerin yeniden konumlandırılması, protein salgılanması, endositoz, nükleer dinamikler, kalsiyum dinamikleri, hücre iskeleti organizasyonu ve netoz hakkında ISMic aracılığıyla elde edilen mekanik bilgilerle tamamlanabilir ve ilişkilendirilebilir. Farmakolojik ve/veya genetik manipülasyonların kullanılması, ilgi sürecinde spesifik moleküler yolların rolünü vurgulayabilir ve bu da bunu benzersiz ve çok güçlü bir yaklaşım haline getirir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi’nin intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

1.5 mL tubes USA Scientific 4036-3204
15 mL tubes Corning 430766
1 mL syringe Covidien 8881501400
27 G needle Kendall 827112
27 G winged infusion set Terumo SV*27EL
30x objective Olympus UPLSAPO30XS 1.05 NA, silicon oil immersion
40x objective Olympus UPLSAPO40XS 1.23 NA, silicon oil immersion
60 mm dishes Falcon 353002
6 mL syringe Kendall 8881516937
Acepromazine (10 mg/mL) Vet one 13985-587-50
ACK lysis buffer Quality Biological 118-156-101
Balance AND EK-1200A
BSA Sigma Aldrich A9647
Cell strainer 40 µm Sigma Aldrich CLS431750
Fiji ImageJ N/A Image visualization/analysis software
Fluoview Software Olympus N/A Acquisition software
FVB mouse strain Jackson N/A FVB background
Gas Anesthesia system Patterson veterinary 07-8915712 Link 7 model
Green Cell tracker Thermo C2925 Solubilized in cell culture grade DMSO to reach 1 mM concentration (1000x)
Hair removal cream Nair N/A
HBSS (w/o Ca2+, Mg2+) Gibco 14175-095
HEPES 1 M pH 7.3 Quality Biological 118-089-721
Histopaque 1077 Sigma Aldrich 10771-100ML
Histopaque 1991 Sigma Aldrich 11191-100ML
Imaris Bitplane N/A Image visualization/analysis software
Isoflurane Vet one 13985-528-40
Ketamine (100 mg/mL) Vet one 13985-584-10
LyzM-cre x mT/mG generated in the lab N/A C57BL/6J background
Manual micromanipulator WPI M3301R
MATLAB MatWorks N/A Analysis software
mtomato mouse strain generated in the lab N/A mT/mG, FVB background
Multiphoton laser Spectra Physics Insight DS+
Multiphoton Microscope Olympus MPE-RS
Nanofil 10 µL syringe WPI NANOFIL
Nanofil 33 G needle WPI NF33BV-2
Objective heater Bioptechs N/A
Objective heater controller Bioptechs 150803
Ophtalmic ointment Major NDC 0904-6488-38
Oxygen concentrator Caire VisionAire 5
PBS (w/o Ca2+, Mg2+) Quality Biological 114-058-131
Saline Quality Biological 114-055-101
Stage heater Okolab N/A
Stage heater controller Okolab H401-T
Surgical tape 3M 1538-1 Hypoallergenic
Syringe driver Harvard Apparatus PHD Ultra
Warming Pads Parkland Scientific A2789B
Warming Pump Parkland Scientific TP-700
Xylazine (100 mg/mL) Vet one 13985-704-10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Oudin, M. J., Weaver, V. M. Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).
  3. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959 (2015).
  4. Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells. International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).
  5. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  6. Wagner, R. . Explanatory panels on physiology and development history 1839. , (1839).
  7. Yaniv, K., et al. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).
  8. Vinegoni, C., et al. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (30), e1510 (2009).
  9. Sack, F. -. U. Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs. Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).
  10. Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy. PloS One. 6 (11), 28237 (2011).
  11. Weigelin, B., Bakker, G. -. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1, 32-43 (2012).
  12. Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review. Cells. 10 (7), 1760 (2021).
  13. Weigelin, B., Bakker, G. -. J., Friedl, P. Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization. Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).
  14. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  15. Shitara, A., et al. Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals. Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).
  16. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  17. Subramanian, B. C., et al. The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation. The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215 (2020).
  18. Yan, S. L. S., Hwang, I. -. Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy. iScience. 16, 283-297 (2019).
  19. Porat-Shliom, N., et al. In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations. Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).
  20. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  21. Calvo-Rodriguez, M., et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 11, 2146 (2020).
  22. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  23. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  24. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586 (2013).
  25. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  26. Lakschevitz, F. S. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  27. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745 (2008).
  28. . MATLAB – Bio-Formats 6.1.0 documentation Available from: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html (2022)
  29. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  30. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  31. Xu, C., Prince, J. L. Snakes, shapes, and gradient vector flow. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).
  32. Driscoll, M. K., et al. Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell. Aging. 4 (2), 119-132 (2012).
  33. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  34. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  35. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), 104250 (2014).
  36. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Wu, X. S., et al. Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).

Tags

Neutrophil MigrationMouse SkinSubcellular Membrane RemodelingIntravital Subcellular Microscopy (ISMic)Multiphoton MicroscopyImmune Cell DynamicsPhysiological ConditionsAdoptive TransferMotion ArtifactsMembrane RemodelingQuantitative Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Melis, N., Subramanian, B., Chen, D., Weigert, R. Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (183), e63581, doi:10.3791/63581 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image