Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee des National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) genehmigt (Protokolle LCMB-031 und LCMB-035) und entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften. Für die Experimente wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter zwischen 2 und 6 Monaten verwendet. mT/mG – und Wildtyp-Wirtsmäuse (WT) befinden sich in einem FVB/NJ-Hintergrund, während sich LyzM-Cre x mTmG-Mäuse in einem C57BL/6-Hintergrund befinden. 1. Materialien und Vorbereitung der Reagenzien und Werkzeuge Röhrchen, Schalen und Nadeln/Spritzen über Nacht unter Rühren mit PBS + 1% BSA (ohne Calcium und Magnesium) bestreichen. Reinigen Sie Oberflächen und Werkzeuge/Instrumente, die für die Tierarbeit verwendet werden sollen, sorgfältig mit 70%igem Ethanol oder durch Autoklavieren.Für die Aufreinigung von Neutrophilen bereiten Sie Folgendes vor: 3 x 15 mL Röhrchen, 1 x 60 mm Schale, 1 x 1,5 mL Röhrchen; HBSS mit 10 mM HEPES (pH 7,3); Lyselösung für rote Blutkörperchen (ACK); Histopak 1077; und Histopaque 1119. Für Neutrophilen-Injektionen bereiten Sie Folgendes vor: 1 x Spritze mit geringem Volumen (10 μl), 1 x 33 g abgeschrägte Nadel, Isofluran und Anästhesielösung (Ketamin, Xylazin und Acepromazin in einer Dosis von 80 mg-kg-1, 2 mg-kg-1 bzw. 4 mg-kg-1 in Kochsalzlösung). 2. Aufreinigung von Neutrophilen aus einer Spendermaus Euthanasieren Sie die Spendermaus gemäß den örtlichen institutionellen Vorschriften. Sammeln Sie lange Knochen des Tieres (Femur, Tibia und Humerus), achten Sie darauf, die Knochenintegrität zu erhalten und vermeiden Sie es, die Knochenköpfe während der Entnahmezu schneiden 24. In einer BSA-beschichteten 60-mm-Schale Muskeln und Fettgewebe entfernen. Schneiden Sie die Knochenköpfe ab, um Zugang zum Knochenmark zu erhalten, und spülen und homogenisieren Sie das Knochenmark dann mit einer mit HBSS gefüllten Spritze (27 G-Nadel). Die Lösung wird mit einem 40-μm-Sieb in ein 15 mL BSA-beschichtetes Röhrchen filtriert und bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet 30 s lang in 1 ml ACK, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und fügen Sie dann 9 ml HBSS hinzu, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 400 x g für 5 min bei RT. Bereiten Sie einen Dichteschrittgradienten in einem 15 mL BSA-beschichteten Röhrchen vor, indem Sie vorsichtig 4 mL 1119 Histopaque auf den Boden des Röhrchens legen und dann vorsichtig 4 mL 1077 Histopaque auf die Oberseite schichten. Achten Sie besonders darauf, dass Sie die beiden Schichten nicht vermischen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 mL HBSS. Schichten Sie die Lösung vorsichtig auf den oben vorbereiteten Stufengradienten. Schleudern Sie bei 1.000 x g für 30 min bei RT mit der geringstmöglichen Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeit (“keine Bremse” wird bevorzugt). Saugen Sie von der Oberseite des Rohrs vorsichtig die Hälfte der 1077 Histopaque-Schicht an. Sammeln Sie die verbleibende Hälfte der 1077 Histopaque-Schicht und die obere Hälfte der 1119 Histopaque-Schicht in einem frischen, BSA-beschichteten Rohr. Die trübe Zellsuspension zwischen den beiden Dichteschichten enthält überwiegend Neutrophile. Fügen Sie HBSS hinzu, um ein Endvolumen von 15 mL zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Bei 400 x g für 5 min bei RT drehen. Nach der Zentrifugation das Zellpellet resuspendieren und mit 10 mL HBSS waschen und bei 400 x g 5 min bei Raumtemperatur schleudern. Wiederholen Sie den Vorgang und resuspendieren Sie dann das Pellet in 15 ml HBSS, um die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler zu bestimmen. Zum Schluss werden die Zellen in 1 ml HBSS gedreht und resuspendiert und in ein 1,5 mL BSA-beschichtetes Röhrchen überführt. Nach der Reinigung ist die Neutrophilensuspension in dem BSA-beschichteten Röhrchen 30 Minuten lang auf einem Röhrchenrotator bei RT bis zur Markierung und/oder Injektion unter sanftem Rühren zu halten.HINWEIS: Eine erfolgreiche Aufreinigung ergibt 10-20 x 106 Neutrophile pro Maus mit einer Reinheit von 95%. Die Reinheit wird mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der zuvor beschriebenen Neutrophilenmarker (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ und CD11b+)25,26 bestimmt.HINWEIS: Protokolle zur Aufreinigung von Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen und dem Knochenmark der Maus sind bereits verfügbar24,27. 3. Markierung von Neutrophilen HINWEIS: Um die Neutrophilen sichtbar zu machen, wurden sie von LyzM-Cre mT/mG-Mäusen gereinigt, in denen myeloische Zellen ein membrangesteuertes Peptid exprimieren, das mit dem GFP fusioniert ist. Zusätzlich wurden gereinigte Neutrophile von Wildtyp-Mäusen (WT) in vitro markiert. Die folgenden Schritte beschreiben das Verfahren zur Markierung gereinigter Neutrophiler mit einem kommerziellen zellpermeablen grünen Fluoreszenzfarbstoff und können an jede andere MPM-kompatible Fluoreszenzsonde der Wahl angepasst werden. Geben Sie den grünen Fluoreszenzfarbstoff (die vom Hersteller empfohlene Konzentration; hier 1 μM) in ein 1,5 mL BSA-beschichtetes Röhrchen zur Neutrophilensuspension (gereinigt von WT-Maus). 30 min bei RT unter sanftem Rühren in einem Röhrchenrotator inkubieren. Dreimal mit HBSS waschen, bei 400 x g für 5 min bei RT schleudern und das Pellet in 1 mL HBSS resuspendieren. Halten Sie die Neutrophilensuspension in dem BSA-beschichteten Röhrchen unter sanftem Rühren in einem Röhrchenrotator bei RT bis zum Injektionsvorgang.HINWEIS: Die Injektion von markierten Neutrophilen, die direkt nach der Markierung durchgeführt wird, wird dringend bevorzugt. Falls erforderlich, können markierte Neutrophile jedoch für weitere 10-15 Minuten nach der Markierung unter Bewegung gehalten werden, ohne die Integrität der Neutrophilenreaktion in vivo zu beeinträchtigen. Langfristiges Rühren (mehr als 60 Minuten nach der Markierung) führt zu Verklumpung, Absterben von Neutrophilen und irreführenden Beobachtungen in vivo. Kurz vor der Injektion resuspendieren Sie das Zellpellet in Kochsalzlösung, um eine Dichte von 2-5 x 106 Zellen pro 20 μl zu erreichen. 4. Neutrophilen-Injektion HINWEIS: Die Anästhesie muss gemäß den Richtlinien des örtlichen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung durchgeführt werden. Setzen Sie das Tier in eine geschlossene Kammer und verabreichen Sie 3%-5% Isofluran (Durchflussrate von 2 l/min) mit einem kalibrierten Verdampfer, der an einen Sauerstoffkonzentrator angeschlossen ist. Beurteilen Sie, ob das Tier bewusstlos ist, indem Sie den Rückzugsreflex der Pfoten beim Einklemmen des Hinterfußballens testen. Legen Sie das Tier dann auf ein Wärmekissen (37° C), um seine Körpertemperatur zu halten. Verabreichen Sie weiterhin das Isofluran (1%-2%; Durchflussrate von 0,5 l/min) durch einen Nasenkonus.SICHERHEITSHINWEIS: Um die Exposition des Personals gegenüber giftigem Isofluran zu begrenzen, wird die Verwendung eines Spendersystems empfohlen, das mit einer Filtereinheit ausgestattet ist, um zirkulierendes Isofluran zurückzugewinnen. Um die Bildqualität zu optimieren, entfernen Sie die Haare mit einem feinen Trimmer aus dem Ohr. Dieses Verfahren könnte auch ein bis zwei Tage vor dem Experiment durchgeführt werden.HINWEIS: Von der Verwendung von Haarentfernungscreme wird abgeraten, da bekannt ist, dass sie die Entzündungsreaktion in der Maushaut verschlimmert und bildgebende Artefakte hervorruft. Lege das Tier auf die Seite. Halten Sie den Rand des Ohrs mit chirurgischem Klebeband fest und glätten Sie ihn entlang des Wärmekissens. Bringen Sie das Klebeband vorsichtig an, um Schäden am Ohr zu vermeiden. Füllen Sie eine mit einer 33 G Nadel bestückte Spritze mit der Neutrophilensuspension (2-5 x 106 Zellen pro 20 μL) und montieren Sie diese auf einen Mikromanipulator.HINWEIS: Der Injektionswinkel zwischen der Nadel und dem Ohr auf einem Wärmekissen muss zwischen 10° und 30° liegen, um Gewebeschäden zu minimieren und den Erfolg der Zellinjektion zu erhöhen. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig (mit der Fase nach oben) in Richtung Ohr und stechen Sie langsam in die Haut. Sobald sich die Nadel in der Haut befindet, drücken Sie langsam auf den Kolben und geben Sie 2-3 μl Zellsuspension ab.HINWEIS: Bereiche mit sichtbaren Blutgefäßen sollten vermieden werden, da die Beschädigung eines Blutgefäßes zu einer unerwünschten und komplexen Immunantwort auf die Injektion und zu Problemen mit der Bildgebung führt. Wiederholen Sie die Injektion in 2-3 verschiedenen Bereichen des Ohrs, vorzugsweise im Abstand von 2-3 mm. “Überfüllen” Sie das Ohr nicht mit der Zellsuspension.HINWEIS: Die Injektion muss in der Mitte des Ohrs durchgeführt werden. Die Peripherie des Ohrs ist dünn und muss mit Vorsicht behandelt werden, da sie leicht beschädigt werden kann, während der mittlere Teil dicker ist und größere Blutgefäße und weniger Haarfollikel enthält und größeren Injektionsvolumina standhalten kann. Entfernen Sie vorsichtig das chirurgische Klebeband und lassen Sie das Tier unter Aufsicht wieder zu Bewusstsein kommen. Lassen Sie das Tier vor der Bildgebung 1 Stunde ruhen, damit sich das Gewebe und die Zellen von der Injektion erholen können. 5. Anästhesie bei IVM HINWEIS: Eine tiefere Anästhesie verbessert die Bildqualität erheblich, indem die Bewegungsartefakte aufgrund von Herzschlag und Atmung verringert werden. Mit Neutrophilen injizierte Mäuse werden einer chemischen Anästhesie unterzogen, die eine tiefere Sedierung als eine gasinduzierte Anästhesie ermöglicht. Die Anästhesie muss gemäß den Richtlinien des örtlichen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung durchgeführt werden. Eine Stunde nach der Genesung von der Neutrophilen-Injektion betäuben Sie die Tiere durch eine subkutane Injektion, die eine Mischung aus Xylazin/Ketamin/Acepromazin (80 mg-kg-1, 2 mg-kg-1 bzw. 4 mg-kg-1) in Kochsalzlösung enthält.HINWEIS: Um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, müssen die Tiere vom Zeitpunkt der Anästhesie bis zum Ende des Versuchs mit einem Heizkissen oder einem Wasserumwälzkissen, das an eine Wärmepumpe angeschlossen ist, warm gehalten werden. Um die Anästhesie über 1 h hinaus aufrechtzuerhalten, injizieren Sie alle 40 Minuten eine Mischung aus Ketamin/Acepromazin (40 mg kg 1 bzw. 2 mg kg 1 ) subkutan. Überwachen Sie anästhesierte Mäuse regelmäßig auf Anzeichen von Bewusstsein, indem Sie den Rückzugsreflex der Pfoten testen. Tragen Sie zusätzlich bei bildgebenden Verfahren, die länger als 1 Stunde dauern, eine sterile, nicht-medikamentöse Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern und die Hydratation des Körpers durch subkutane Injektionen von Kochsalzlösung (200 μl pro Stunde) aufrechtzuerhalten.HINWEIS: Alternativ kann ein digital gesteuertes perfusionsbasiertes System verwendet werden, um eine periodische und reibungslose Injektion der Anästhesielösung und/oder die Bereitstellung von Flüssigkeiten zu gewährleisten. Ein automatisierter Spritzentreiber kann so eingerichtet werden, dass er das gewünschte Anästhesievolumen abgibt und über längere Zeiträume für Feuchtigkeit sorgt. Zu diesem Zweck kann eine geflügelte Infusionsnadel subkutan in die Rückenhaut des Tieres eingeführt und mit chirurgischem Klebeband gesichert werden. 6. Bildgebung HINWEIS: Der Tieraufbau und die hier beschriebenen Bildgebungsparameter sind für ein inverses Multiphotonenmikroskop optimiert, das mit einer einzigen Laserlinie ausgestattet ist, um Emissionen von den verschiedenen Fluorophoren anzuregen und gleichzeitig zu sammeln. Bevor Sie das betäubte Tier auf den Mikroskoptisch legen, stellen Sie sicher, dass das Mikroskop eingeschaltet ist und dass sowohl der Tisch als auch die Linsen auf 37 °C vorgeheizt sind. Decken Sie das Loch auf der Bühne mit einem Glasdeckglas (Dicke #1 oder 1,5) ab, das auf die beheizte Linse ausgerichtet ist. Bewegen Sie das Tier vorsichtig auf die Bühne. Wenn die Bildgebung über einen längeren Zeitraum (>1 h) geplant ist, tragen Sie eine Augensalbe auf und sichern Sie das auf Flügelinfusionen basierende Perfusionssystem wie oben beschrieben. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Mitte des Deckglases und legen Sie das neutrophile Ohr darauf. Glätten Sie das Ohr vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in der Mitte des Deckglases, um Lufteinschlüsse zu entfernen.HINWEIS: Das Auftragen von Kochsalzlösung (oder PBS) zwischen Ohr und Deckglas reduziert die Lichtbrechung aufgrund von Lufteinschlüssen und sorgt so für einen gleichmäßigen Brechungsindex und eine hervorragende Bildqualität. Sichern Sie das Ohr, indem Sie ein Holzstäbchen (vom Wattestäbchen entfernt) vorsichtig an die Seite des Ohrs drücken, näher an den Kopf des Tieres und es mit Klebeband verriegeln (Abbildung 1A).HINWEIS: Ein gesicherter Holzstab minimiert Bewegungsartefakte durch Herzschlag und Atmung und erhöht die Bildqualität erheblich. Wichtig ist, dass der Holzstab gerade so fest angezogen werden muss, dass das Ohr stabilisiert wird, ohne die Durchblutung zu beeinträchtigen. Suchen Sie mit dem Mikroskop-Okular einen Interessenbereich und wechseln Sie dann in den Multiphotonen-Erfassungsmodus. Stellen Sie die Laseranregungswellenlänge auf 900-930 nm ein, um die gleichzeitige Erfassung von GFP/grünem Fluoreszenzfarbstoff, mTomate sowie Kollagen-I (über SHG) zu ermöglichen. Stellen Sie die entsprechenden Spiegel und Filterkombinationen auf die Detektoren ein, um das emittierte Licht zu sammeln (Bandpassfilter: Blau = 410-460 nm, Grün = 495-540 nm, Rot = 580-640 nm).HINWEIS: Injizierte Neutrophile Pflanzen, die mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, weisen eine starke grüne Fluoreszenz auf, die sie unter dem Mikroskop-Okular sichtbar macht, selbst wenn sie in tiefere Teile des Ohrs injiziert werden. Bestimmen Sie die Einstellung, die für die Hardwarekonfiguration am besten geeignet ist. Auch wenn migrierende Zellen mit einem Intervall von 30 s bis 1 min verfolgt werden können, können subzelluläre Ereignisse mit einer höheren Geschwindigkeit (mindestens <10 s Intervall) abgebildet werden. Im folgenden Beispiel werden zwei verschiedene Bildgebungsaufbauten vorgestellt, um den Unterschied zwischen klassischer IVM und ISMic zu verdeutlichen.Beim klassischen IVM-Ansatz zur Verfolgung der Zellmigration und zur Untersuchung des Wirtsmausgewebes (Abbildung 1) verwenden Sie eine 30-fache Linse und einen Galvo-Scanner mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln (Pixelgröße von 0,83 μm) und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit dem motorisierten Tisch mit einer Schrittweite von 2 μm ein, was die Abbildung eines 30 μm tiefen Volumens alle 30 s ermöglicht. Verwenden Sie im ISMic-Ansatz zur Abbildung eines hochdynamischen Membranumbaus bei höherer Vergrößerung und Auflösung (Abbildung 2) eine 40-fache Linse und einen Resonanzscanner mit 3-facher Mittelwertbildung und einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln (Pixelgröße von 0,25 μm) und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit einem Piezo mit einer Schrittweite von 1 μm ein. Ermöglicht die Bildgebung eines 20 μm tiefen Volumens alle 4-5 s. Lösen Sie die Migration von Neutrophilen aus, indem Sie eine sterile Laserverletzung induzieren. Der Anregungslaser wird mit einer hohen Leistung, die ausreicht, um mindestens 80 mW22 zu erreichen, 10 s lang auf einen schmalen Bereich des Gewebes (20 μm x 20 μm) fokussiert. Identifizieren Sie die laserinduzierte Verletzung durch ihre starken autofluoreszierenden Signale, die in allen Kanälen auftreten, und durch die daraus resultierende Veränderung der Kollagenanordnung (Abbildung 1D).HINWEIS: Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, muss die Verletzung immer so weit wie möglich von den Blutgefäßen entfernt induziert werden. Wenn sie gerissen werden, beeinträchtigen Blutzellen, die in das Gewebe freigesetzt werden, die Bildgebungsqualität und führen zu einer starken Immunreaktion. Speichern Sie die Daten am Ende des Experiments für weitere Analysen. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den örtlichen institutionellen Richtlinien. Bei Bedarf kann Gewebe zur Fixierung und Weiterverarbeitung entnommen werden. 7. Repräsentative Datenanalyse HINWEIS: Die Daten können entweder mit der Mikroskopsoftware, Software von Drittanbietern oder benutzerdefinierten Programmen visualisiert und analysiert werden. Das Verfahren und die verwendeten Werkzeuge hängen von den spezifischen Bedürfnissen der Prüfärzte ab. Hier ist ein Beispiel für einen Arbeitsablauf zur Quantifizierung der Membrankrümmung und der lokalen Flächenänderungen an der Vorder- und Rückseite der wandernden Neutrophilen. Öffnen Sie die Bildgebungsdateien mit Imaris oder Fiji, um die Wanderung der Neutrophilen in 4D zu visualisieren und die Qualität des Experiments zu bestimmen.HINWEIS: Imaris und Fiji können das Bildgebungsformat mehrerer Mikroskopmarken lesen. Verarbeiten Sie die Daten mit den folgenden Schritten, indem Sie benutzerdefinierte MATLAB-Codeskripte ausführen. Lesen Sie die ausgewählten Bildgebungsdateien mit dem Bio-Formats28-Paket für MATLAB. Segmentieren Sie jeden Frame des 3D-Volumens mit dem Otsu-Algorithmus29 , um die einzelnen Zellen zu identifizieren. Verfolgen Sie die identifizierten Objekte anhand des Kriteriums der minimalen Verschiebung30. Bestimmen Sie die aktiven Konturen und Berandungen des Objekts.Generieren Sie eine maximale Projektion für jedes Objekt, das in einem Zeitrahmen identifiziert wurde. Wenden Sie die Funktion bwboundaries in MATLAB auf die max-projection jedes identifizierten Objekts aus Schritt 7.2 an, um 100 Begrenzungspunkte zu generieren. Optimieren Sie die mit dem dynamischen Konturalgorithmus identifizierten Grenzpunkte, um eine Subpixelgenauigkeit31 zu erreichen (Abbildung 3A) unter Verwendung der Funktionen in dem MATLAB-Paket, das über http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/ heruntergeladen wurde. Überlagern Sie die Begrenzungen für das Objekt und den durch die Verfolgung in Schritt 7.3 ermittelten Objektbahnindex mit der maximalen Projektion des Originalbildes, um eine Ausgabe eines 2D-überlagerten Films zur Visualisierung und manuellen Überprüfung zu erzeugen. Wählen Sie im überlagerten Film manuell alle Objekte aus, die als migrierende Zellen identifiziert wurden, indem Sie Objekte, die keine Zellen sind, berührende Objekte und Objekte mit unvollständigen Begrenzungen ausschließen. Zeichnen Sie die Tracking-Indizes, Start- und Endframes jeder Zellenleitkurve in einer Tabellenkalkulation auf, die als Eingabe für die folgenden Schritte verwendet wird, die von MATLAB-Codeskripten implementiert werden. Verfolgen Sie die Zellenbegrenzungspunkte von jedem Frame zum nächsten gemäß dem Kriterium der minimalen Verschiebung. Verwenden Sie die Funktion Polyarea in MATLAB, um die durch benachbarte Grenzpunkte unterstrichene Fläche in zwei aufeinanderfolgenden Zeitrahmen zu berechnen (Abbildung 3C). Wenn sich die lokale Zellengrenze von der Zelle nach außen bewegt, weisen Sie der Bereichsänderung ein positives Vorzeichen zu. Wenn sich die lokale Zellengrenze nach innen zur Zelle bewegt, weisen Sie der Bereichsänderung ein negatives Vorzeichen zu. Messen Sie die lokale Membrankrümmung an jedem Begrenzungspunkt für jeden Rahmen, indem Sie die benachbarten Begrenzungspunkte an einen Kreis anpassen (5 pro Seite; insgesamt 11)32 (Abbildung 3B). Generieren Sie Kymographen mit der Funktion imagesc in MATLAB (Abbildungen 3D,E), um die Veränderungen der subzellulären Merkmale im Laufe der Zeit anzuzeigen und sich auf die Position der Zelle zu beziehen.