JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

הדמיה של נדידת נויטרופילים בעור העכבר כדי לחקור עיצוב מחדש של קרום תת-תאי בתנאים פיזיולוגיים

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63581
, , ,
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research,National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,UNC-Chapel Hill

Summary

נדידת נויטרופילים מסתמכת על עיצוב מחדש מהיר ומתמשך של קרום הפלזמה בתגובה לכימואטרקנט והאינטראקציות שלו עם המיקרו-סביבה החוץ-תאית. מתואר כאן הליך המבוסס על מיקרוסקופ תת-תאי תוך תאי כדי לחקור את הדינמיקה של עיצוב מחדש של ממברנות בנויטרופילים המוזרקים לאוזן של עכברים מורדמים.

Abstract

חקר גיוס תאי מערכת החיסון ותפקודם ברקמות הוא תחום פעיל מאוד בשני העשורים האחרונים. נויטרופילים הם בין תאי החיסון הראשונים שהגיעו לאתר הדלקת והשתתפו בתגובה החיסונית המולדת במהלך זיהום או נזק לרקמות. עד כה, נדידת נויטרופילים הודגמה בהצלחה באמצעות מערכות ניסוי שונות במבחנה המבוססות על גירוי אחיד, או הגירה מוגבלת תחת אגרוז, או ערוצים מיקרו-פלואידים. עם זאת, מודלים אלה אינם משחזרים את המיקרו-סביבה המורכבת שנויטרופילים נתקלים בה in vivo. פיתוח טכניקות מבוססות מיקרוסקופ מולטיפוטון (MPM), כגון מיקרוסקופ תת-תאי תוך תאי (ISMic), מציע כלי ייחודי לדמיין ולחקור דינמיקה של נויטרופילים ברזולוציות תת-תאיות בתנאים פיזיולוגיים. בפרט, האוזן של עכבר מורדם חי מספקת יתרון ניסיוני לעקוב אחר נדידת נויטרופילים בזמן אמת בשל קלות הנגישות שלה והיעדר חשיפה כירורגית. ISMic מספק את הרזולוציה האופטית, המהירות ועומק הרכישה הדרושים כדי לעקוב אחר תהליכים תאיים וחשוב מכך, תהליכים תת-תאיים בתלת-ממד לאורך זמן (4D). יתר על כן, הדמיה רב-מודאלית של מיקרו-סביבה אינטרסטיציאלית (כלומר, כלי דם, תאים תושבים, מטריצה חוץ-תאית) יכולה להתבצע בקלות באמצעות שילוב של עכברים טרנסגניים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים נבחרים, תיוג אקסוגני באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, פלואורסצנטיות פנימית של רקמות, ואותות הרמוניים שניים/שלישיים. פרוטוקול זה מתאר 1) הכנת נויטרופילים להעברה מאומצת לאוזן העכבר, 2) הגדרות שונות לדימות תת-תאי אופטימלי, 3) אסטרטגיות למזעור ממצאים תנועתיים תוך שמירה על תגובה פיזיולוגית, 4) דוגמאות לעיצוב מחדש של ממברנות שנצפו בנויטרופילים באמצעות ISMic, ו-5) זרימת עבודה לניתוח כמותי של עיצוב מחדש של ממברנות בנויטרופילים נודדים in vivo.

Introduction

נדידת תאים מכוונת היא אירוע קריטי המתרחש במהלך תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, כולל התפתחות, תגובה חיסונית, תיקון רקמות והתחלת גידול, התקדמות והפצה 1,2. תהליך זה מסתמך על אותות כימוטקטיים חוץ-תאיים ספציפיים החשים על ידי הקולטנים הקוגניטיביים שלהם בקרום הפלזמה ולאחר מכן מומרים לאותות תוך-תאיים מורכבים. מסלולים אלה, בתורם, מפעילים נדידת תאים באמצעות סדרה של תגובות, כולל הפעלה מקומית של השלד הציטו-שלד, סחר בקרום ועיצובו מחדש, וקיטוב התא3. שני סוגים שונים של נדידת תאים אופיינו היטב: מזנכימלית ואמבואידית4. נדידה מזנכימלית איטית יחסית (10 מיקרומטר לדקה) ומשתמשת בהידבקויות חלשות כדי לנווט דרך ה-ECM. ללא קשר למודאליות, נדידת תאים דורשת עיצוב מחדש מתמיד של קרום הפלזמה וכתוצאה מכך יצירת מבנים בולטים בקצה המוביל של התאים, אשר מתואמים היטב עם נסיגה של הממברנה בחלק האחורי1.

כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליכים תת-תאיים אלה, חיוני לדמיין את הדינמיקה של הממברנות בתאים נודדים ברזולוציה זמנית ומרחבית מתאימה. יתר על כן, מכיוון שעיצוב מחדש של הממברנה מושפע מאוד מתכונות המיקרו-סביבה של הרקמה המקיפה את התאים הנודדים, חיוני לדמיין תהליך זה ישירות ברקמה המקומית, בתוך בעלי חיים חיים. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני (IVM)5. הדמיית IVM הראשונה בוצעה לפני ~200 שנה, כאשר האקסטרווספיה של לויקוציטים הודגמה באמצעות מיקרוסקופ הארה טרנס פשוט6 ולאחר מכן IVM שימש בעיקר על יצורי מודל שקופים למחצה, כגון דגי זברה ודרוזופילה 7,8. בשני העשורים האחרונים, IVM שימש בהצלחה לחקר תהליכים תאיים בעכברים, חולדות ויונקים גדולים יותר כגון חזירים 5,9. הדבר התאפשר הודות ל-1) התפתחויות משמעותיות במיקרוסקופ קונפוקלי ורב-פוטונים (MP) ו-2) העלאת טכנולוגיית עריכת גנים כגון CRISPR-Cas9, שאפשרה הנדסה מהירה של מגוון מודלים של בעלי חיים כדי לבטא חלבונים מתויגים פלואורסצנטית וכתבים. חוץ מזה, ההדמיה של תאים בודדים והמיקרו-סביבה שלהם במהלך תהליכים כגון התחלת גידולים, נדידת תאים ותגובה חיסונית התאפשרה על ידי שתי צורות אחרות של תיוג אקסוגני, כגון החדרה מערכתית של צבעים כדי לתייג את כלי הדם10,11, ועירור של מולקולות אנדוגניות, כגון קולגן באמצעות הדור ההרמוני השני (SHG)10, 12 וסיבי עצב באמצעות הדור ההרמוני השלישי (THG)11,13. לבסוף, שיפור בטכניקות למזעור ממצאי התנועה עקב פעימות לב ונשימה הוביל לפיתוח מיקרוסקופ תת-תאי תוך תאי (ISMic), אשר איפשר לחוקרים לדמיין ולחקור מספר אירועים תת-תאיים ישירות בבעלי חיים ברמת רזולוציה דומה לאלה שנצפו במבחנה 14,15,16,17 . דוגמאות ל-ISMic כוללות חקירת דינמיקה ציטו-שלדית במהלך אקסוציטוזה 14,15,16,17 ואנדוציטוזה 15, עיצוב מחדש דינמי של שלד ציטו-שלד במהלך נדידת תאים17,18, לוקליזציה ומטבוליזם של מיטוכונדריה19,20, ואיתות סידן במוח 21.

פרוטוקול זה מפרט את השלבים והנהלים השונים לחקר עיצוב מחדש של קרום התא ברזולוציה תת-תאית במהלך נדידת נויטרופילים בעור האוזן של עכבר חי באמצעות ISMic. גישה זו מבוססת על פרוטוקולים22,23 שתוארו קודם לכן ומותאמת להשגת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה יותר.

Protocol

כל הניסויים והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי המכון הלאומי לסרטן (המכונים הלאומיים לבריאות, בת’סדה, MD, ארה”ב) הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקולים LCMB-031 ו- LCMB-035) ועמדו בכל התקנות האתיות הרלוונטיות. עכברים זכרים ונקבות בגילאי 2 עד 6 חודשים שימשו לניסויים. עכברי mT/mG ועכברים מארחים מסוג פרא (WT) נמצאים ברקע FVB/NJ ואילו עכברי LyzM-Cre x mTmG נמצאים ברקע C57BL/6. 1. חומרים והכנת ריאגנטים וכלים מצפים צינורות, כלים ומחטים/מזרקים עם PBS + 1% BSA (ללא סידן ומגנזיום) למשך הלילה תחת תסיסה. נקו בקפידה משטחים וכלים/מכשירים שישמשו לעבודה עם בעלי חיים תוך שימוש באתנול 70% או על ידי אוטוקלאבינג.לטיהור נויטרופילים, הכינו את הדברים הבאים: 3 x 15 מ”ל צינורות, 1 x 60 מ”מ צלחת, 1 x 1.5 מ”ל צינור; HBSS המכיל 10 mM HEPES (pH 7.3); תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (ACK); היסטופק 1077; והיסטופק 1119. לזריקות נויטרופילים, הכינו את הפריטים הבאים: 1 x מזרק בנפח נמוך (10 μL), 1 x 33 G מחט משופעת, איזופלורן ותמיסת הרדמה (קטמין, קסילזין ואצפרומזין ב-80 מ”ג·ק”ג-1, 2 מ”ג·ק”ג-1 ו-4 מ”ג·ק”ג-1, בהתאמה, בתמיסת מלח). 2. טיהור נויטרופילים מעכבר תורם יש להרדים את העכבר התורם בהתאם לתקנות המוסדיות המקומיות. אספו עצמות ארוכות מהחיה (עצם הירך, השוקה וההומרוס), תוך שימת לב לשמירה על שלמות העצם והימנעות מחיתוך ראשי העצמות במהלך האיסוף24. בצלחת מצופה BSA בקוטר 60 מ”מ, הסירו את השרירים ואת רקמת השומן. חתכו את ראשי העצמות כדי לקבל גישה למח העצם, ולאחר מכן שטפו והומוגניזציה של מח העצם באמצעות מזרק (מחט 27 גרם) מלא HBSS. סנן את התמיסה לתוך צינור מצופה BSA של 15 מ”ל באמצעות מסננת של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה אותה במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב 1 מ”ל של ACK למשך 30 שניות כדי ליזה את תאי הדם האדומים, ולאחר מכן הוסיפו 9 מ”ל של HBSS כדי לעצור את הליזה. צנטריפוגה את התמיסה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT. הכינו שיפוע שלב צפיפות בצינור מצופה BSA של 15 מ”ל על ידי הצבה עדינה של 4 מ”ל של 1119 Histopaque בתחתית הצינור, ולאחר מכן שכבות עדינות של 4 מ”ל של 1077 Histopaque בחלק העליון. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מערבוב בין שתי השכבות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב -2 מ”ל של HBSS. הניחו בעדינות את התמיסה על גבי שיפוע השלבים שהוכן למעלה. סחרור במהירות של 1,000 x גרם במשך 30 דקות ב-RT עם מהירות ההאצה וההאטה הנמוכה ביותר האפשרית (עדיף “ללא בלם”). מראש הצינור, שואפים בעדינות מחצית משכבת ההיסטופק 1077. אספו את המחצית הנותרת של שכבת 1077 Histopaque ואת החצי העליון של שכבת Histopaque 1119 לתוך צינור טרי מצופה BSA. תרחיף התאים העכור בין שתי שכבות הצפיפות מכיל בעיקר נויטרופילים. הוסיפו HBSS כדי להגיע לנפח סופי של 15 מ”ל וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור. סובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב- RT. לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש ולשטוף את גלולת התא עם 10 מ”ל של HBSS ולהסתובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על ההליך, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 15 מ”ל של HBSS כדי לקבוע את מספר התאים באמצעות מונה תאים. לבסוף, סובבו והשעו מחדש תאים ב-1 מ”ל HBSS והעבירו לצינור מצופה BSA בנפח 1.5 מ”ל. לאחר הטיהור, יש לשמור את מתלה הנויטרופילים בצינור המצופה ב-BSA תחת תסיסה עדינה למשך 30 דקות על מסובב צינור ב-RT עד לתיוג ו/או הזרקה.הערה: טיהור מוצלח מניב 10-20 x 106 נויטרופילים לכל עכבר עם טוהר של 95%. טוהר מוערך באמצעות ציטומטריית זרימה, באמצעות סמני נויטרופילים שתוארו בעבר (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ ו- CD11b+)25,26.הערה: פרוטוקולים לטיהור נויטרופילים מדם היקפי אנושי ומח עצם עכבר זמינים בעבר24,27. 3. תיוג נויטרופילים הערה: כדי להמחיש את הנויטרופילים, הם טוהרו מעכברי LyzM-Cre mT/mG , שבהם תאים מיאלואידים מבטאים פפטיד ממוקד קרום המאוחה עם GFP. בנוסף, נויטרופילים מטוהרים מעכברי בר (WT) סומנו במבחנה. השלבים הבאים מתארים את ההליך המשמש לסימון נויטרופילים מטוהרים בצבע פלואורסצנטי ירוק מסחרי החדיר לתאים, וניתן להתאים אותם לכל בדיקה פלואורסצנטית תואמת MPM אחרת לפי בחירתם. הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי הירוק (הריכוז המומלץ על ידי היצרן; כאן, 1 מיקרומטר) לתרחיף הנויטרופילים (מטוהר מעכבר WT) בצינור מצופה BSA בנפח 1.5 מ”ל. יש לדגור במשך 30 דקות ב-RT תחת תסיסה עדינה במסובב צינורות. שטפו שלוש פעמים באמצעות HBSS, סחררו ב-400 x גרם במשך 5 דקות ב-RT, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ”ל HBSS. שמור את מתלה הנויטרופילים בצינור מצופה BSA תחת תסיסה עדינה במסובב צינור ב- RT עד להליך ההזרקה.הערה: הזרקת נויטרופילים מסומנים המבוצעת מיד לאחר התיוג עדיפה מאוד. עם זאת, במידת הצורך, נויטרופילים מסומנים יכולים להישמר תחת תסיסה למשך 10-15 דקות נוספות לאחר התיוג מבלי לפגוע בשלמות תגובת הנויטרופילים in vivo. תסיסה ארוכת טווח (יותר מ -60 דקות לאחר התיוג) תוביל לגושים, מוות נויטרופילים ותצפיות מטעות in vivo. ממש לפני ההזרקה, להשהות מחדש את גלולת התא בתמיסת מלח כדי להגיע לצפיפות של 2-5 x 106 תאים לכל 20 μL. 4. הזרקת נויטרופילים הערה: ההרדמה חייבת להתבצע בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הניחו את בעל החיים בתא סגור ותנו איזופלורן 3%-5% (קצב זרימה של 2 ליטר/דקה) באמצעות וופורייזר מכויל המחובר לרכז חמצן. הערך אם בעל החיים מחוסר הכרה על ידי בדיקת רפלקס נסיגה של כפות הרגליים בעת צביטת כרית כף הרגל האחורית. לאחר מכן, העבירו את בעל החיים למשטח חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גופו. המשך מתן האיזופלורן (1%-2%; ספיקה של 0.5 ליטר/דקה) דרך חרוט האף.הערת בטיחות: כדי להגביל את חשיפת הצוות לאיזופלורן רעיל, מומלץ להשתמש במערכת מתקן המצוידת ביחידת סינון כדי ללכוד מחדש איזופלורן במחזור. כדי לייעל את איכות ההדמיה, הסירו את השערות מהאוזן באמצעות גוזם עדין. הליך זה יכול להתבצע גם יום או יומיים לפני הניסוי.הערה: השימוש בקרם להסרת שיער אינו מומלץ מכיוון שהוא ידוע כמחמיר תגובה דלקתית בעור העכבר ומציג ממצאי הדמיה. הניחו את בעל החיים על צדו. בעזרת סרט ניתוח, החזיקו את קצה האוזן ושטחו אותה לאורך כרית החימום. החל בעדינות את הסרט כדי למנוע נזק לאוזן. מלא מזרק מצויד מחט 33 G עם השעיה נויטרופילים (2-5 x 10,6 תאים לכל 20 μL) ולהרכיב אותו על micromanipulator.הערה: זווית ההזרקה בין המחט לאוזן בכרית חימום חייבת להיות בין 10° ל-30° כדי למזער את הנזק לרקמות ולהגביר את הצלחת הזרקת התא. הזיזו בעדינות את המחט (עם השיפוע כלפי מעלה) לכיוון האוזן, וניקבו לאט את העור. ברגע שהמחט נמצאת בתוך העור, דחפו לאט את הבוכנה וספקו 2-3 מיקרוליטר של תרחיף תאים.הערה: יש להימנע מאזורים עם כלי דם גלויים, שכן פגיעה בכלי דם גורמת לתגובה חיסונית לא רצויה ומורכבת להזרקה ולבעיות בהדמיה. חזור על ההזרקה ב 2-3 אזורים שונים של האוזן, רצוי 2-3 מ”מ זה מזה. אין “למלא יתר על המידה” את האוזן בהשעיית התא.הערה: יש לבצע את ההזרקה במרכז האוזן. הפריפריה של האוזן דקה ויש לטפל בה בזהירות מכיוון שהיא עלולה להיפגע בקלות, בעוד החלק המרכזי עבה יותר המכיל כלי דם גדולים יותר ופחות זקיקי שיער, ויכול לעמוד בנפחי הזרקה גדולים יותר. הסר בזהירות את סרט הניתוח ותן לבעל החיים לחזור להכרה תחת פיקוח. אפשר לבעל החיים לנוח במשך שעה אחת לפני ההדמיה כדי לאפשר לרקמה ולתאים להתאושש מהליך ההזרקה. 5. הרדמה ל- IVM הערה: הרדמה עמוקה יותר משפרת באופן משמעותי את איכות ההדמיה על ידי הפחתת ממצאי התנועה עקב דופק ונשימה. עכברים המוזרקים על ידי נויטרופילים נתונים להרדמה כימית, המספקת הרגעה עמוקה יותר מאשר הרדמה הנגרמת על ידי גז. ההרדמה חייבת להתבצע בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. שעה לאחר ההחלמה מהזרקת נויטרופילים, מרדימים את בעלי החיים על ידי זריקה תת עורית המכילה תערובת של קסילזין/קטמין/אצפרומזין (80 מ”ג·ק”ג-1, 2 מ”ג·ק”ג-1 ו-4 מ”ג·ק”ג-1, בהתאמה) בתמיסת מלח.הערה: כדי להבטיח שחזור ואמינות של התוצאות, יש לשמור על חום בעלי החיים מרגע ההרדמה ועד סוף הניסוי באמצעות כרית חימום או כרית זרימת מים המחוברת למשאבת חימום. כדי לשמור על הרדמה מעבר לשעה, יש להזריק תערובת של קטמין/אצפרומזין (40 מ”ג·ק”ג-1, ו-2 מ”ג·ק”ג-1 בהתאמה) תת עורית כל 40 דקות. עקוב אחר עכברים מורדמים מעת לעת עבור סימני הכרה על ידי בדיקת רפלקס נסיגה כפות. בנוסף, עבור הליכי הדמיה הנמשכים יותר משעה אחת, יש למרוח משחה אופתלמית סטרילית ללא תרופות על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההרדמה ולשמור על לחות הגוף על ידי הזרקות תת עוריות של תמיסת מלח (200 מיקרוליטר בכל שעה).הערה: לחילופין, ניתן להשתמש במערכת מבוססת זילוח מבוקרת דיגיטלית כדי להבטיח הזרקה תקופתית וחלקה של תמיסת ההרדמה ו / או לספק נוזלים. ניתן להגדיר התקן מזרק אוטומטי כדי לספק את נפח ההרדמה הרצוי ולספק הידרציה לפרקי זמן ארוכים יותר. לשם כך, מחט עירוי מכונפת ניתן להחדיר תת עורית לתוך העור הגבי של החיה מאובטח עם סרט כירורגי. 6. הדמיה הערה: מערך בעלי החיים ופרמטרי ההדמיה המתוארים כאן מותאמים למיקרוסקופ מולטיפוטון הפוך המצויד בקו לייזר יחיד כדי לעורר ולאסוף בו זמנית פליטות מהפלואורופורים השונים. לפני הנחת בעל החיים המרדים על שלב המיקרוסקופ, ודא כי המיקרוסקופ מופעל וכי הן השלב והן העדשות מחוממים מראש ל 37 מעלות צלזיוס. כסו את החור על הבמה עם כיסוי זכוכית (עובי #1 או 1.5) המיושר עם העדשה המחוממת. העבר את החיה אל הבמה בזהירות. אם ההדמיה מתוכננת למשך זמן ארוך (>1 שעות), יש למרוח משחת עיניים ולאבטח את מערכת הזילוח המבוססת על עירוי מכונף כמתואר לעיל. הניחו טיפת מלח על מרכז הכיסוי והניחו מעליה את האוזן המוזרקת לנויטרופילים. שטחו בעדינות את האוזן באמצעות צמר גפן סטרילי לאורך מרכז הכיסוי כדי להסיר כיסי אוויר.הערה: מריחת מי מלח (או PBS) בין האוזן לכיסוי מפחיתה את שבירת האור עקב כיסי האוויר, ובכך מבטיחה מדד שבירה אחיד ואיכות הדמיה מעולה. אבטחו את האוזן על-ידי לחיצה עדינה על מקל עץ (שהוסר ממקלון הצמר גפן) לצד האוזן קרוב יותר לראש החיה ונעילתו באמצעות סרט הדבקה (איור 1A).הערה: מקל עץ מאובטח ממזער את התנועה עקב פעימות הלב והנשימה ומגביר באופן דרמטי את איכות ההדמיה. חשוב לציין, מקל העץ חייב להיות מהודק בדיוק מספיק כדי לייצב את האוזן מבלי לפגוע בזרימת הדם. באמצעות עינית המיקרוסקופ, למצוא אזור עניין, ולאחר מכן לעבור למצב רכישת multiphoton. הגדר את אורך גל עירור הלייזר ל- 900-930 ננומטר כדי לאפשר רכישה בו זמנית של צבע פלואורסצנטי GFP/ירוק, mTomato וכן קולגן-I (באמצעות SHG). הגדר סט מתאים של מראות ושילוב מסננים על הגלאים כדי לאסוף את האור הנפלט (מסנני פסים: כחול = 410-460 ננומטר, ירוק = 495-540 ננומטר, אדום = 580-640 ננומטר).הערה: נויטרופילים מוזרקים, כאשר הם מסומנים בצבע ירוק-פלואורסצנטי, מציגים פלואורסצנטיות ירוקה חזקה הגורמת להם להיראות מתחת לעינית המיקרוסקופ גם אם הם מוזרקים לחלקים עמוקים יותר של האוזן. קבע את ההגדרה המתאימה ביותר לתצורת החומרה. גם אם ניתן לעקוב אחר תאים נודדים במרווח של 30 שניות עד דקה אחת, תמונה של אירועים תת-תאיים במהירות גבוהה יותר (מרווח של <10 שניות לפחות). בדוגמה שלהלן, שני מערכי הדמיה שונים מוצגים כדי להראות את ההבדל בין IVM קלאסי ו- ISMic.בגישת IVM הקלאסית כדי לעקוב אחר נדידת תאים ולחקור את רקמת העכבר המארח (איור 1), השתמשו בעדשת 30x ובסורק גלבו עם גודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל של 0.83 מיקרומטר), וקבעו תזוזה של ציר z באמצעות השלב הממונע עם גודל צעד של 2 מיקרומטר, המאפשר הדמיה של נפח עומק של 30 מיקרומטר כל 30 שניות. בגישה ISMic לעיצוב מחדש של ממברנות דינמיות ביותר בהגדלה וברזולוציה גבוהות יותר (איור 2), השתמש בעדשת 40x ובסורק תהודה עם ממוצע של פי 3 וגודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים (גודל פיקסל של 0.25 מיקרומטר), והגדר תזוזה של ציר z באמצעות piezo עם גודל צעד של 1 מיקרומטר, המאפשר הדמיה בנפח של 20 מיקרומטר כל 4-5 שניות. לעורר נדידת נויטרופילים על ידי גרימת פגיעת לייזר סטרילית. מקד את לייזר העירור בעוצמה גבוהה מספיק כדי להגיע לפחות 80 mW22, על שטח צר של הרקמה (20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר) במשך 10 שניות. זהו את הפגיעה הנגרמת על-ידי הלייזר על-ידי האותות הפלואורסצנטיים האוטומטיים החזקים המופיעים בכל התעלות ועל-ידי השינוי בסידור הקולגן כתוצאה מכך (איור 1D).הערה: כדי להשיג תוצאות אמינות, הפציעה חייבת תמיד להיגרם רחוק ככל האפשר מכלי הדם; אם הם נקרעים, תאי הדם המשתחררים לרקמה ישפיעו על איכות ההדמיה וכן יגרמו לתגובה חיסונית כללית חזקה. שמור את הנתונים בסוף הניסוי לניתוחים נוספים. יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות. במידת הצורך, ניתן לאסוף רקמות לצורך קיבוע ועיבוד נוסף. 7. ניתוח נתונים מייצג הערה: ניתן להציג ולנתח נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, תוכנת צד שלישי או תוכניות מותאמות אישית. ההליך והכלים בהם נעשה שימוש תלויים בצרכים הספציפיים של החוקרים. מוצגת כאן דוגמה אחת לתהליך עבודה לכימות עקמומיות הממברנה ושינויי שטח מקומיים בקצה המוביל והאחורי של הנויטרופילים הנודדים. פתח את קבצי ההדמיה עם אימריס או פיג’י כדי לדמיין את נדידת הנויטרופילים ב- 4D ולקבוע את איכות הניסוי.הערה: אימריס ופיג’י יכולות לקרוא את פורמט ההדמיה של מספר מותגי מיקרוסקופ. עבד את הנתונים באמצעות השלבים הבאים על-ידי הפעלת סקריפטים מותאמים אישית של קוד MATLAB. קראו את קובצי ההדמיה שנבחרו עם חבילת Bio-Formats28 עבור MATLAB. פלח כל מסגרת של נפח 3D עם אלגוריתם Otsu29 כדי לזהות את התאים הבודדים. עקוב אחר האובייקטים המזוהים בהתבסס על קריטריון התזוזה המינימלי30. קבעו את קווי המתאר והגבולות הפעילים של העצם.צור הקרנה מרבית לכל אובייקט שזוהה במסגרת זמן. החילו את הפונקציה bwborders ב- MATLAB על ההקרנה המרבית של כל אובייקט מזוהה משלב 7.2 ליצירת 100 נקודות גבול. מטבו את נקודות הגבול המזוהות עם אלגוריתם קווי המתאר הדינמיים כדי להשיג דיוק תת-פיקסל31 (איור 3A) באמצעות הפונקציות בחבילת MATLAB שהורדו דרך http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. שכבו-על את גבולות האובייקט ואת אינדקס מסלול האובייקט שנקבע על-ידי המעקב בשלב 7.3 עם ההקרנה המרבית של התמונה המקורית כדי להפיק פלט של סרט דו-ממדי עם שכבת-על לצורך תצוגה חזותית ובדיקה ידנית. בסרט השכבת-על, בחרו ידנית בכל העצמים המזוהים כתאים נודדים באמצעות אי-הכללת עצמים שאינם תאים, נגיעה בעצמים ועצמים עם גבולות לא מלאים. רשום את מדדי המעקב, מסגרות ההתחלה והסיום של כל מסלולי תא בגיליון אלקטרוני שישמש כקלט עבור השלבים הבאים המיושמים על ידי סקריפטים של קוד MATLAB. עקוב אחר נקודות הגבול של התא מכל מסגרת למסגרת הבאה בהתאם לקריטריון התזוזה המינימלי. השתמשו בפונקציה Polyarea ב- MATLAB כדי לחשב את השטח המסומן בקו תחתון על-ידי נקודות גבול סמוכות בשתי מסגרות זמן רצופות (איור 3C). אם גבול התא המקומי זז החוצה מהתא, הקצה סימן חיובי לשינוי האזור. אם גבול התא המקומי נע פנימה לתא, הקצה סימן שלילי לשינוי האזור. מדדו את עקמומיות הממברנה המקומית בכל נקודת גבול עבור כל מסגרת על-ידי התאמת נקודות הגבול השכנות למעגל (5 לכל צד; סה”כ 11)32 (איור 3B). צרו קימוגרפים באמצעות פונקציית התמונות ב-MATLAB (איורים 3D,E) כדי להראות את השינויים בתכונות התת-תאיות לאורך זמן ולהתייחס למיקום התא.

Representative Results

כאן, שתי קבוצות שונות של תוצאות מוצגות כדי להמחיש IVM קלאסי ו- ISMic המספקים רזולוציה תאית ותת-תאית, בהתאמה. בדוגמה הראשונה, נויטרופילים טוהרו מעכבר מסוג פרא (WT), שסומן בירוק גשש תאים כדי להכתים את הציטופלסמה, והוזרקו לעכבר מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי המכוון לקרום הפלזמה (עכבר mTomato, הידוע גם בשם mT/mG33, איור 1 וסרט 1 וסרט 2). עכבר מושתל זה איפשר הדמיה של מאפיינים מבניים ברקמת האוזן כגון כלי דם, תאים שוכנים וזקיקי שיער (איור 1C וסרט 1) באמצעות גישה מבוססת IVM (שלב 6.8.1). סיבי קולגן, שהתגלו באמצעות SHG (זוהה במחצית אורך הגל של העירור), סודרו ברשת מורכבת בדרמיס, שם הוזרקו נויטרופילים. לאורך קצה זקיקי השערה (HF) נצפתה שכבה של תאי אפיתל (כלומר, קרטינוציטים). מדי פעם הודגמו ממצאים משאריות שערות שגרמו לשקע מקומי של העור (H). הפציעות שנגרמו על-ידי לייזר הודגמו בקלות הודות לפלואורסנציה האוטומטית החזקה שלהן שזוהתה בכל התעלות ועל-ידי השינויים בסידור הקולגן (איור 1D). תצוגה מלאה יותר של ארכיטקטורת התלת-ממד של העור והלוקליזציה של הנויטרופילים המוזרקים ניתן להעריך בסרט 1, המתאר ערימת Z של העור מהשכבה החיצונית לשכבה הפנימית ועיבוד נפח תלת-ממדי. הדמיה בהילוך מהיר הראתה את הנויטרופילים דוגמים את עור האוזן ומתקשרים עם ECM ורקמת המארח (סרט 2). הדמיה ברזולוציה זו וקבלת ערימת Z כל 30 שניות מאפשרת ביצוע מעקב אחר תאים, ומדידה של פרמטרים של תנועתיות (כלומר, מהירות וכיווניות), אך ניתוח מדויק ומפורט של עיצוב מחדש של ממברנות מאתגר ברזולוציה זו. בדוגמה השנייה, עיצוב מחדש של הממברנה הוערך באמצעות גישת ISMic (שלב 6.8.2) באמצעות נויטרופילים המבטאים mGFP שטוהרו מעכברי LyzM-cre mT/mG והוזרקו לחיות WT (איור 2A, תרשים זרימה ניסיוני). באמצעות פרוטוקול ISMic (סרט 3 ותמונות סטילס באיור 2B) ועם פגיעת לייזר, נצפה עיצוב מחדש דינמי של קרום הפלזמה במהלך הנדידה, והיווצרות בליטות קרום בקצה המוביל ונסיגה של החלק האחורי של התאים מודגמות בבירור (איור 2 וסרט 3). רצפי קיטועי הזמן המודגשים בסרט 3 חושפים את מורכבות האינטראקציות עם ECM. ואכן, נויטרופילים נדדו דרך החלל הבין-תאי, ונעו לאורך הסיבים או ברווחים שביניהם. לבסוף, היבטים כמותיים כגון השינויים בעקמומיות ושינויי השטח בחזית ובחלק האחורי של התאים כומתו עבור כל נקודת זמן. באמצעות התא המתואר באיור 2B כדוגמה, הדינמיקה המקומית של קרום הפלזמה נותחה באמצעות צינור אלגוריתם (ראו שלב 7) בהתבסס על זיהוי של 100 נקודות גבול מתחת לפני השטח של התא (איור 3A). השינויים בעקמומיות המקומית (איור 3B) ובאזור המודגש על-ידי בליטות קרום הפלזמה (איור 3C) חושבו עבור כל נקודת גבול ודווחו עבור כל מסגרת זמן כקימוגרפים (איור 3D,E). גם החלק הקדמי וגם החלק האחורי של התאים שומרים על עקמומיות גבוהה יותר מאשר הצד של התאים (איור 3D); שינויי אזורים שליליים (נסיגות, אזורים כחולים) בולטים יותר בחלק האחורי של התאים מאשר בקצה המוביל שבו שינויי האזור החיובי בולטים יותר (בליטות, אזורים אדומים) (איור 3E). איור 1: IVM של נויטרופילים בעור האוזן של העכבר. (A) שרטוט סכמטי של מערך האוזן על במת המיקרוסקופ. (B) תרשים זרימה ניסיוני. (C) תמונה מייצגת של עור האוזן של עכבר mTomato המוזרק עם נויטרופילים המסומנים באופן פלואורסצנטי, עם הקרנות שונות. זקיק שיער (HF), כלי דם (BV), אפידרמיס (E), דרמיס (D), שכבת תאי בסיס (BCL) וחפץ שיער (עקב שאריות שיער על פני העור, H). (D) תמונה מייצגת של עור עכבר לאחר פגיעת לייזר סטרילית: ערוץ כחול (מימין), ערוץ ירוק וערוץ אדום (באמצע), תמונה ממוזגת (משמאל). הפציעה נראית בצד שמאל של התמונה על ידי פליטה אוטופלואורסצנטית חזקה בערוצים ירוקים ואדומים, כמו גם הפרעה של ECM שנצפתה על ידי היווצרות חור בסיבי קולגן-I. ב C ו – D, ירוק: נויטרופילים; אדום: רקמת מארח עכבר; ציאן: קולגן-I SHG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: קיטועי זמן של נדידת נויטרופילים mGFP באוזן עכבר WT. (A) תרשים זרימה ניסיוני. (B) תמונות סטילס מייצגות מסרט 3. (C) עיבוד נפח של אותו תא כדי להמחיש את הארגון התלת-ממדי של הממברנה. האזור של דינמיקת קרום גבוהה מומחש על ידי חץ (אדום עבור נסיגה וכחול עבור בליטה). (D) תצוגה חזותית מקרוב והטיה של נפח התא המעובד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: צינור ניתוח לכימות דינמיקת ממברנות שנאסף באמצעות ISMic. (A) קביעת קווי מתאר של תאים וחלוקה מחדש של נקודות גבול (100 נקודות גבול) בין שתי מסגרות עוקבות עבור נויטרופילים mGFP המתוארים באיור 2B. (B) גבולות צבעוניים מייצגים עקמומיות קרום מקומית שנקבעה לכל נקודת גבול. (C) האזור המקומי משתנה בין שתי מסגרות עוקבות (נוכחי: כחול והבא: אדום). האזורים הירוקים מייצגים את תוצאות המעקב של תנועת הממברנה המקומית. חצים צהובים מציינים את הכיוון הכללי של תזוזת הממברנה. (D) קימוגרף עקמומיות גבול של התא לאורך זמן. הציר האנכי מייצג את מדדי נקודות הגבול כאשר 1 ו- 100 מייצגים את החלק האחורי של התא בהתאם לכיוון הנדידה שלו. (E) קימוגרף שינוי שטח מקומי המשקף את בליטת הממברנה (אדום) ואת נסיגת הממברנה (כחול) של התא לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. סרט 1: נויטרופילים מסומנים בירוק בהדגמה באוזן עכבר mTomato באמצעות IVM. אדום: רקמת עכבר מארח mTomato. ציאן: קולגן-I SHG; ירוק: נויטרופיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 2: IVM של נויטרופילים נודדים בעור אוזני עכבר mTomato. סרטונים הם הקרנות בעוצמה מרבית של אוסף תמונות שנרכש למשך 27 דקות עם קצב פריימים של 5 פריימים לשנייה. אדום: רקמת עכבר מארח mTomato. ציאן: קולגן-I SHG; ירוק: נויטרופיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 3: ISMic של עיצוב מחדש של קרום במהלך נדידת נויטרופילים באוזן עכבר WT. סרטונים הם הקרנות בעוצמה מרבית של אוסף תמונות שנרכש למשך 8 דקות עם קצב פריימים של 10 פריימים לשנייה. אדום: רקמת עכבר מארח mTomato. ציאן: קולגן-I SHG; ירוק: נויטרופיל mGFP; ירוק בהיר: נויטרופיל מעובד. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Discussion

למרות עשרות שנים של התקדמות בתחום נדידת תאים ועיצוב מחדש של ממברנה, מעט מאוד מחקרים השתמשו ב- IVM כדי להמחיש תכונות תת-תאיות בבעלי חיים חיים. ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מספקים כלי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות על נדידת נויטרופילים בבעלי חיים ובאופן ספציפי יותר על עיצוב מחדש של קרום הפלזמה במהלך תהליך זה. גישה זו מאפשרת לחקור נדידת נויטרופילים בתנאים פיזיולוגיים בהתחשב במורכבות האינהרנטית של מיקרו-סביבת הרקמה. ואכן, השימוש ב- MPM מאפשר הדמיה של תכונות מרובות ברקמה המארחת באמצעות שילוב של זני עכבר המבטאים סמנים פלואורסצנטיים נבחרים, תיוג רקמות אקסוגניות, עירור פלואורסצנטיות אנדוגנית ואותות הנוצרים באמצעות SHG או THG12,13.

נושא פוטנציאלי אחד שיש לקחת בחשבון בהליך זה הוא נזק לאור. למרות MPM הוא בדרך כלל בטוח יותר מאשר מיקרוסקופ קונפוקלי ביחס photobleaching ו phototoxicity, יש לנקוט בזהירות בעת הדמיה רקמות חיות34. פוטוטוקסיות יכולה לעכב באופן דרסטי את התוצאות על ידי יצירת תוצרי הדמיה החל מכתמים בהירים קטנים לאזורים גדולים יותר של רקמה פגומה או מעכבת/מגרה מגוון מסלולים תוך-תאיים. כדי למנוע פוטוטוקסיות, יש לשמור על עוצמת לייזר מינימלית ולתכנן את הבקרות המתאימות כדי לוודא שהתנאים הפיזיולוגיים נשמרים (למשל, מדידת זרימת הדם, בדיקות לעקה חמצונית)35,36. יתר על כן, בהליך ספציפי זה, המערב את העור, זנים לבקנים מומלצים מאוד מכיוון שהמלנין הקיים בבעלי פרווה כהה רגיש יותר לפוטוטוקסיות 36,37,38.

בין המגבלות העיקריות של ההליך הן מערכת המיקרוסקופ בשימוש ואת אופי נויטרופילים. למרות ששימוש ב-MPM מגדיל משמעותית את עומק הדמיית הרקמה בהשוואה לטכניקות אחרות של מיקרוסקופ אור (למשל, קונפוקל, דיסק מסתובב), היכולת לדמיין דינמיקה תת-תאית באוזן מוגבלת לשכבות החיצוניות ביותר של הרקמה (80-100 מיקרומטר). הסיבה לכך היא פיזור האור האינטנסיבי המיוצר על ידי שכבת ECM העבה המקשה על חקירת הגירה בשכבות העמוקות יותר. מגבלה נוספת היא העובדה שנויטרופילים הם קצרי חיים מאוד ולא ניתן לשמור אותם בתרבית מספיק זמן כדי לבצע טכניקות עריכה גנטית. ניתן להתגבר על כך על ידי עכברים הנדסיים לייצר נויטרופילים חסרי גנים ספציפיים או בעלי מוטציות נבחרות, מה שכמובן מגדיל את עלויות המחקר ואת משך הזמן.

ההליכים המתוארים כאן, למרות שתוכננו לחקור דינמיקה של ממברנה, יכולים להיות מותאמים לענות על כל שאלה ביולוגית של התא לא רק בנויטרופילים אלא גם בסוגי תאים חיסוניים אחרים ובתאים נודדים. המידע שנאסף באמצעות IVM בהגדלה נמוכה על התנהגויות תאיות (למשל, פנוטיפ נודד, מהירות התא וכיווניות22) יכול להיות משלים ומתואם עם מידע מכניסטי שנרכש באמצעות ISMic על מיקום מחדש של אברונים, הפרשת חלבונים, אנדוציטוזה, דינמיקה גרעינית, דינמיקה של סידן, ארגון שלד ציטו-שלד ונטוזיס. השימוש במניפולציות פרמקולוגיות ו / או גנטיות יכול להדגיש את תפקידם של מסלולים מולקולריים ספציפיים בתהליך העניין, מה שהופך את זה לגישה ייחודית וחזקה מאוד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר intramural של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן, המרכז לחקר הסרטן.

Materials

1.5 mL tubes USA Scientific 4036-3204
15 mL tubes Corning 430766
1 mL syringe Covidien 8881501400
27 G needle Kendall 827112
27 G winged infusion set Terumo SV*27EL
30x objective Olympus UPLSAPO30XS 1.05 NA, silicon oil immersion
40x objective Olympus UPLSAPO40XS 1.23 NA, silicon oil immersion
60 mm dishes Falcon 353002
6 mL syringe Kendall 8881516937
Acepromazine (10 mg/mL) Vet one 13985-587-50
ACK lysis buffer Quality Biological 118-156-101
Balance AND EK-1200A
BSA Sigma Aldrich A9647
Cell strainer 40 µm Sigma Aldrich CLS431750
Fiji ImageJ N/A Image visualization/analysis software
Fluoview Software Olympus N/A Acquisition software
FVB mouse strain Jackson N/A FVB background
Gas Anesthesia system Patterson veterinary 07-8915712 Link 7 model
Green Cell tracker Thermo C2925 Solubilized in cell culture grade DMSO to reach 1 mM concentration (1000x)
Hair removal cream Nair N/A
HBSS (w/o Ca2+, Mg2+) Gibco 14175-095
HEPES 1 M pH 7.3 Quality Biological 118-089-721
Histopaque 1077 Sigma Aldrich 10771-100ML
Histopaque 1991 Sigma Aldrich 11191-100ML
Imaris Bitplane N/A Image visualization/analysis software
Isoflurane Vet one 13985-528-40
Ketamine (100 mg/mL) Vet one 13985-584-10
LyzM-cre x mT/mG generated in the lab N/A C57BL/6J background
Manual micromanipulator WPI M3301R
MATLAB MatWorks N/A Analysis software
mtomato mouse strain generated in the lab N/A mT/mG, FVB background
Multiphoton laser Spectra Physics Insight DS+
Multiphoton Microscope Olympus MPE-RS
Nanofil 10 µL syringe WPI NANOFIL
Nanofil 33 G needle WPI NF33BV-2
Objective heater Bioptechs N/A
Objective heater controller Bioptechs 150803
Ophtalmic ointment Major NDC 0904-6488-38
Oxygen concentrator Caire VisionAire 5
PBS (w/o Ca2+, Mg2+) Quality Biological 114-058-131
Saline Quality Biological 114-055-101
Stage heater Okolab N/A
Stage heater controller Okolab H401-T
Surgical tape 3M 1538-1 Hypoallergenic
Syringe driver Harvard Apparatus PHD Ultra
Warming Pads Parkland Scientific A2789B
Warming Pump Parkland Scientific TP-700
Xylazine (100 mg/mL) Vet one 13985-704-10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Oudin, M. J., Weaver, V. M. Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).
  3. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959 (2015).
  4. Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells. International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).
  5. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  6. Wagner, R. . Explanatory panels on physiology and development history 1839. , (1839).
  7. Yaniv, K., et al. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).
  8. Vinegoni, C., et al. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (30), e1510 (2009).
  9. Sack, F. -. U. Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs. Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).
  10. Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy. PloS One. 6 (11), 28237 (2011).
  11. Weigelin, B., Bakker, G. -. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1, 32-43 (2012).
  12. Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review. Cells. 10 (7), 1760 (2021).
  13. Weigelin, B., Bakker, G. -. J., Friedl, P. Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization. Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).
  14. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  15. Shitara, A., et al. Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals. Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).
  16. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  17. Subramanian, B. C., et al. The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation. The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215 (2020).
  18. Yan, S. L. S., Hwang, I. -. Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy. iScience. 16, 283-297 (2019).
  19. Porat-Shliom, N., et al. In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations. Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).
  20. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  21. Calvo-Rodriguez, M., et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 11, 2146 (2020).
  22. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  23. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  24. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586 (2013).
  25. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  26. Lakschevitz, F. S. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  27. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745 (2008).
  28. . MATLAB – Bio-Formats 6.1.0 documentation Available from: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html (2022)
  29. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  30. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  31. Xu, C., Prince, J. L. Snakes, shapes, and gradient vector flow. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).
  32. Driscoll, M. K., et al. Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell. Aging. 4 (2), 119-132 (2012).
  33. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  34. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  35. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), 104250 (2014).
  36. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Wu, X. S., et al. Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).

Tags

Neutrophil MigrationMouse SkinSubcellular Membrane RemodelingIntravital Subcellular Microscopy (ISMic)Multiphoton MicroscopyImmune Cell DynamicsPhysiological ConditionsAdoptive TransferMotion ArtifactsMembrane RemodelingQuantitative Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Melis, N., Subramanian, B., Chen, D., Weigert, R. Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (183), e63581, doi:10.3791/63581 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image