Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu
Summary
Atomik kuvvet mikroskobu girinti protokolü, normal veya kısıtlı büyüme sırasında (yani su açığı altında) bir doku veya organın belirli bir hücresinin hücre duvarının fiziksel özelliklerinin rolünü inceleme imkanı sunar.
Abstract
Burada, canlı Arabidopsis köklerinin epidermal hücrelerinin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, optik ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile birleştirilmiş bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile nanogirintiler yoluyla karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, deformasyonunu ölçerken numuneye kontrollü kuvvetler uygulamaktan oluşur ve hücre altı çözünürlüklerde görünür Young hücre duvarı modülü gibi parametrelerin nicelleştirilmesine izin verir. Numunenin dikkatli bir mekanik immobilizasyonunu ve girintilerin ve girinti derinliklerinin doğru seçimini gerektirir. Sadece dış dokularda kullanılabilmesine rağmen, bu yöntem gelişim sırasında bitki hücre duvarlarındaki mekanik değişikliklerin karakterize edilmesine izin verir ve bu mikroskobik değişikliklerin tüm organın büyümesiyle korelasyonunu sağlar.
Introduction
Bitki hücreleri, hücre tipine ve büyüme evresi 1,2’ye bağlı olarak kalınlığı 0.1 ila birkaç μm arasında değişen polisakkaritler, proteinler, metabolitler ve su ağlarından oluşan karmaşık bir yapı olan bir hücre duvarı ile çevrilidir. Hücre duvarı mekanik özellikleri bitkilerin büyümesinde önemli bir rol oynar. Hücre duvarının düşük sertlik değerleri, hücre büyümesi ve hücre duvarı genişlemesi için bir ön koşul olarak önerilmiştir ve tüm hücrelerin işlevlerini yerine getirmek için mekanik kuvvetler algıladığına dair kanıtlar artmaktadır. Bununla birlikte, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin hücre kaderini belirleyip belirlemediği hala tartışılmaktadır 2,3,4. Bitki hücreleri gelişim sırasında hareket etmediğinden, bir organın son şekli, bir hücrenin ne kadar uzağa ve hangi yönde genişlediğine bağlıdır. Bu nedenle, Arabidopsis kökü, hücre duvarının fiziksel özelliklerinin hücre genişlemesindeki etkisini incelemek için iyi bir modeldir, çünkü kökün farklı bölgelerinde farklı genişleme türleri meydana gelir. Örneğin, anizotropik genişleme uzama bölgesinde ve özellikle epidermal hücrelerde belirgin şekilde belirgindir5.
Burada açıklanan yöntem, epidermal hücrelerin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, ters çevrilmiş bir floresan faz mikroskobu6 ile birleştirilmiş bir Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak canlı Arabidopsis köklerinin nano ölçeğinde karakterize etmek için kullanılmıştır. AFM tekniğinin kapsamlı bir revizyonu için 7,8,9’u okuyun.
Bu protokol, temel bir numune hazırlama yöntemini ve bitki hücre duvarlarının AFM tabanlı elastikiyetini ölçmek için genel bir yöntemi özetlemektedir.
Şekil 1: Arabidopsis köklerinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak yapılan kuvvet-girinti deneyine şematik genel bakış. Şema, kök örneğini sıkıca hareketsiz hale getirmek için substratın hazırlanmasından (1-2), propidium iyodür boyama yoluyla kök canlılığının doğrulanmasından (3), birincil kökün uzatılmış bir epidermal hücresinin yüzeyinde konsol konumlandırmasından (4-5), kuvvet eğrileri ölçümünden (6) ve görünür Young modülünü hesaplamak için kuvvet eğrisi işlemesinden (7-8) bir Kuvvet-Girinti deneyinin adımlarına genel bir bakış sunar. EZ: uzama bölgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre ve hücre duvarı mekaniği, mekaniğin büyüme süreçlerini nasıl etkilediğine dair fikir edinmek için giderek daha alakalı hale geliyor. Fiziksel kuvvetler katı dokularda önemli mesafelere yayıldıkça, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin ve bunların bitkinin büyümesini nasıl algıladıkları, kontrol edildikleri, ayarlandıkları ve etkiledikleri üzerine yapılan çalışmalar önemli bir çalışma alanı haline gelmektedir 2,3,8<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma CSIC I + D 2018, hibe No. 95 (Mariana Sotelo Silveira) tarafından finanse edilmiştir.; CSIC Grupos (Omar Borsani) ve PEDECIBA.
Materials
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101 (2002).
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
