Summary

Microscopie à force atomique pour étudier les propriétés physiques des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis

Published: March 31, 2022
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Summary

Le protocole d’indentation par microscopie à force atomique offre la possibilité de disséquer le rôle des propriétés physiques de la paroi cellulaire d’une cellule particulière d’un tissu ou d’un organe pendant une croissance normale ou contrainte (c’est-à-dire sous déficit hydrique).

Abstract

Une méthode est décrite ici pour caractériser les propriétés physiques de la paroi cellulaire des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis par nanoindentations avec un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope optique à fluorescence inversée. La méthode consiste à appliquer des forces contrôlées à l’échantillon tout en mesurant sa déformation, ce qui permet de quantifier des paramètres tels que le module apparent de Young des parois cellulaires à des résolutions subcellulaires. Cela nécessite une immobilisation mécanique minutieuse de l’échantillon et une sélection correcte des pénétrateurs et des profondeurs d’indentation. Bien qu’elle ne puisse être utilisée que dans les tissus externes, cette méthode permet de caractériser les changements mécaniques dans les parois cellulaires végétales au cours du développement et permet la corrélation de ces changements microscopiques avec la croissance d’un organe entier.

Introduction

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi cellulaire qui est une structure complexe composée de réseaux en interaction de polysaccharides, de protéines, de métabolites et d’eau dont l’épaisseur varie de 0,1 à plusieurs μm selon le type cellulaire et la phase de croissance 1,2. Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire jouent un rôle essentiel dans la croissance des plantes. De faibles valeurs de rigidité de la paroi cellulaire ont été proposées comme condition préalable à la croissance cellulaire et à l’expansion de la paroi cellulaire, et il est de plus en plus évident que toutes les cellules détectent les forces mécaniques pour remplir leurs fonctions. Cependant, il est encore débattu si les changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire déterminent le destin cellulaire 2,3,4. Parce que les cellules végétales ne bougent pas pendant le développement, la forme finale d’un organe dépend de la distance et de la direction dans laquelle une cellule se développe. Ainsi, la racine d’Arabidopsis est un bon modèle pour étudier l’impact des propriétés physiques de la paroi cellulaire dans l’expansion cellulaire, car différents types d’expansion se produisent dans différentes régions de la racine. Par exemple, l’expansion anisotrope est évidente dans la zone d’élongation et particulièrement perceptible dans les cellules épidermiques5.

La méthode décrite ici a été utilisée pour caractériser les propriétés physiques de la paroi cellulaire des cellules épidermiques à l’échelle nanométrique des racines vivantes d’Arabidopsis à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope à phase de fluorescence inversée6. Pour une révision approfondie de la technique AFM, lire 7,8,9.

Ce protocole décrit une méthode de préparation d’échantillons de base et une méthode générale pour les mesures d’élasticité basées sur AFM des parois cellulaires végétales.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de l’expérience d’indentation de force dans les racines d’Arabidopsis à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Le schéma donne un aperçu des étapes d’une expérience de force-indentation depuis la préparation du substrat pour immobiliser fermement l’échantillon racinaire (1-2), la confirmation de la viabilité de la racine par coloration à l’iodure de propidium (3), le positionnement en porte-à-faux à la surface d’une cellule épidermique allongée de la racine primaire (4-5), la mesure des courbes de force (6) et le traitement de la courbe de force pour calculer le module de Young apparent (7-8). EZ : zone d’allongement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Préparation du matériel végétal et conditions de croissance Pour générer le matériel végétal nécessaire, stérilisez les graines de type sauvage d’Arabidopsis et les lignées mutantes d’intérêt.REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé ce qui suit: ttl1: Lignes d’insertion de l’ADN-T Salk_063943 (pour TTL1; AT1G53300) – Columbia-0 (Col-0) de type sauvage; le mutant Procuste1 (prc1-1), qui consiste en une mutation knock-out (Q…

Representative Results

Expériences d’indentation de forceLe texte suivant présente certains résultats attendus lorsqu’une expérience d’indentation de force est menée pour montrer la sortie typique à attendre lorsque le protocole est bien exécuté. Courbes force-déplacementLes diagrammes d’indentation de force représentative qui ont été obtenus en indentant des échantillons vivants à une position placée au centre de la cellule de la zone d’élongation …

Discussion

La mécanique des cellules et des parois cellulaires devient de plus en plus pertinente pour mieux comprendre comment la mécanique affecte les processus de croissance. Comme les forces physiques se propagent sur des distances considérables dans les tissus solides, l’étude des changements dans les propriétés physiques de la paroi cellulaire et comment ils sont détectés, contrôlés, réglés et impactent la croissance de la plante devient un domaine d’étude important <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par CSIC I+D 2018, subvention n ° 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) et PEDECIBA.

Materials

1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.
AFM software Bruker, Billerica, MA, USA
Atomic force microscopy (AFM) BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Probe holder-fluid Bruker, Billerica, MA, USA CAT-FCH A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.  Also compatible with air operation.
Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 Gonotech, Berlin, Germany
Murashige & Skoog Medium Duchess Biochemie M0221 Original concentration, (1962)
Optical inverted microscope coupled to the AFM Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina 100429 Neutral, non acidic silicone glue
Petri dishes Deltalab 200201.B Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.
Propidium iodide Sigma P4170 For root viability test.
Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A Bruker, Billerica, MA, USA DNP-10/A For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever,  with a spring constant of 0.35 N/m.
Tweezers Sigma T4537

References

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Cite This Article
Rauschert, I., Benech, J. C., Sainz, M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, M. Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots. J. Vis. Exp. (181), e63533, doi:10.3791/63533 (2022).

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