Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis
Summary
El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).
Abstract
Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.
Introduction
Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento 1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para realizar sus funciones. Sin embargo, todavía se debate si los cambios en las propiedades físicas de la pared celular determinan el destino celular 2,3,4. Debido a que las células vegetales no se mueven durante el desarrollo, la forma final de un órgano depende de qué tan lejos y en qué dirección se expande una célula. Por lo tanto, la raíz de Arabidopsis es un buen modelo para estudiar el impacto de las propiedades físicas de la pared celular en la expansión celular porque se producen diferentes tipos de expansión en diferentes regiones de la raíz. Por ejemplo, la expansión anisotrópica es evidente en la zona de elongación y particularmente notable en las células epidérmicas5.
El método descrito aquí se utilizó para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas a nanoescala de raíces vivas de Arabidopsis utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio de fase de fluorescencia invertida6. Para una revisión extensa de la técnica AFM, lea 7,8,9.
Este protocolo describe un método básico de preparación de muestras y un método general para mediciones de elasticidad basadas en AFM de paredes celulares vegetales.
Figura 1: Resumen esquemático del experimento de indentación de fuerza en raíces de Arabidopsis utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El esquema ofrece una visión general de los pasos de un experimento de Fuerza-Indentación desde la preparación del sustrato para inmovilizar firmemente la muestra de raíz (1-2), la confirmación de la viabilidad de la raíz a través de la tinción de yoduro de propidio (3), el posicionamiento en voladizo en la superficie de una célula epidérmica alargada de la raíz primaria (4-5), la medición de curvas de fuerza (6) y el procesamiento de la curva de fuerza para calcular el módulo de Young aparente (7-8). EZ: zona de elongación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio </s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación ha sido financiada por el CSIC I+D 2018, beca nº 95 (Mariana Sotelo Silveira); CSIC Grupos (Omar Borsani) y PEDECIBA.
Materials
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
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