מכשירים אלקטרוניים אורגניים גמישים לטיפול בשדה חשמלי פועם של גליובלסטומה

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לחקיקה הצרפתית ובהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילה האירופית מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר על בעלי חיים אושר על ידי Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône ואושר על ידי הוועדה האתית של Provence Cote D’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. מיקרו-ייצור גמיש של מכשירים (איור 1) ניקוי מגלשות הזכוכיתמחליקות זכוכית סוניקט בתמיסת סבון 2% למשך 15 דקות. שטפו אותם במים. יש להוסיף שוב תערובת של 80% אצטון טהור ו-20% איזופרופנול טהור למשך 15 דקות.אזהרה: ממיסים אלה מזיקים ודליקים. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולטפל בהם מתחת למכסה מנוע. שוטפים את המגלשות עם איזופרופנול ומייבשים עם אקדח אוויר.הערה: ודאו שהאצטון לא מתייבש על המצע במהלך כל התהליך. דפוס אלקטרודות זהב (איור 1A)הפקדת שכבה של 3 מיקרומטר של פארילן-C (PaC) עם מערכת שקיעת פארילן (איור 1Aa).הניחו את מגלשות הזכוכית המנוקות בתא התצהיר. רססו סבון על הצ’ילר, תנו לו להתייבש והכניסו אותו למלכודת הקרה הייעודית של מערכת השיקוע. חומר נוגד הדבקה זה מאפשר הסרה קלה של PaC מהצ’ילר לאחר התצהיר.אזהרה: PaC הוא חומר מגרה ומהווה סכנה בריאותית. יש ללבוש כפפות בזמן הטיפול בו. שוקלים 6 גרם של PaC בסירת אלומיניום ומניחים אותו בכבשן. פנה את המכונה (P = 10 mTorr) והתחל את התצהיר עם הפרמטרים הבאים:T Chiller = -100 °C,תנור T = 690 °C,וופורייזר T = 175 °Cותא T = 135 °C. כאשר התצהיר מסתיים וטמפרטורת הוופורייזר נמוכה מ-40°C, כבו את הצ’ילר, הוופורייזר והתנור. אווררו את המכונה ואספו את הדגימות. הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 30 s (100 W, 50 sccm). ציפו את הדגימות שטופלו בפלזמה בהתנגדות אור שלילית ב-1,000 x גרם למשך 40 שניות. הניחו את הדגימות על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Ab).זהירות: תמיסת photoresist דליקה וגורמת לגירוי; לבשו PPE וטפלו בו מתחת למכסה מנוע. מקמו מסנן i-line בקו האלומה של מיישר המגע בפס רחב UV וחשפו את התנגדות האור דרך מסיכה הכוללת את עיצוב האלקטרודה הבין-ספרתית (איור 1Ac).הערה: אלקטרודות אינטרדיגיטציה עם רווח של 50 או 250 מיקרומטר תוכננו באמצעות עורך פריסה ומסכות פוטו הוזמנו מחברה המייצרת מסכות פוטו פוליאסטר על ידי צילום לייזר. אפו את הדגימות הנ”ל בטמפרטורה של 110°C על צלחת חמה במשך 3 דקות ותנו להן להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. טבלו דגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 3 דקות כדי להסיר את התנגדות האור שאינה חשופה. שטפו דגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Ad).זהירות: הפתרון למפתחים הוא מטרד; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 60 s (100 W, 50 sccm). הפקידו שכבת הדבקה של 20 ננומטר של כרום ושכבת זהב של 300 ננומטר עם מאייד תרמי כדלקמן (איור 1Ae). אווררו את מכונת המאייד וחתכו את הדגימות (הפונות כלפי מטה) על הצלחת העגולה העליונה בעזרת ברגי מתכת. מלאו את כורי ההיתוך הימורים, בהתאמה, בכרום ובזהב. אטמו ופנו את המכונה כדי להגיע ללחץ מתחת ל-5·10-6 Torr. התחל את הסיבוב של מחזיק הדגימה. בחר את כור ההיתוך המכיל כרום והגדל לאט את הזרם העובר דרכו עד שתגיע לקצב שיקוע של 0.2 Å·s-1 . פתח את התריס והמתן עד 20 ננומטר של כרום מופקד. סגור את התריס והגביר באיטיות את הזרם עד 0 mA. בחר את כור ההיתוך המכיל זהב והגדל לאט את הזרם העובר דרכו עד שתגיע לשיעור שיקוע של 0.2 Å·s-1 . פתח את התריס כדי לאדות זהב, המתן עד להפקדת 10 ננומטר של זהב, ולאחר מכן הגדל את שיעור התצהיר ל -1.5 Å·s-1 עד להפקדה של כ -300 ננומטר. סגור את התריס והגביר באיטיות את הזרם ל- 0 mA. תנו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאחר התצהיר. עצור את הסיבוב של מחזיק הדגימה, אוורר את המכונה ואסוף את הדגימות. לטבול את הדגימות בכוס עם אצטון. הניחו את הכד על צלחת ניעור שנקבעה במהירות 110 סל”ד למשך 15 דקות כדי להרים את התנגדות הצילום. שטפו את הדגימות עם איזופרופנול וייבשו אותן עם אקדח אוויר (איור 1Af). הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 30 s (100 W, 50 sccm). הפקדת שכבת בידוד של 3 מיקרומטר של PaC עם מערכת שיקוע פארילן (ראה שלב 1.2.1) (איור 1Ag). פתיחת מיתאר (איור 1B)סובב לצפות את הדגימות עם photoresist חיובי ב 600 x גרם במשך 35 שניות. הניחו אותו על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Ba).זהירות: תמיסת photoresist דליקה וגורמת לגירוי; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. ודא שאין מסנן i-line בקו הקורה של יישור המגע בפס רחב UV וחשוף את photoresist דרך מסיכה הכוללת את קווי המתאר של ההתקן עם יישור מגע UV בפס רחב (איור 1Bb). טבלו את הדגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 4 דקות כדי להסיר את ההתנגדות לאור שנחשפה. שטפו את הדגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Bc). חרטו את קווי המתאר דרך שתי השכבות של PaC עם חריטת יונים תגובתית (160 W, 22 דקות, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (איור 1Bd). הסר את photoresist הנותרים עם אצטון, לשטוף עם isopropanol, ולייבש את הדגימות עם אקדח אוויר. PEDOT:ציפוי PSS (איור 1C)ציפו תמיסת סבון 2% ב-70 x גרם במשך 35 שניות (איור 1Ca). הפקדת שכבת הקרבה של 3 מיקרומטר של PaC עם מערכת שיקוע פארילן (ראה שלב 1.2.1) (איור 1Cb). התנגדות פוטו חיובית למעיל מסתובב במהירות של 600 x גרם למשך 35 שניות. הניחו את הדגימות על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Cc). ודא שאין מסנן קו i בקו הקורה של יישור המגע בפס רחב UV וחשוף את התנגדות האור דרך מסיכה הכוללת את פני השטח הפעילים של האלקטרודות (איור 1Cd). טבלו את הדגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 4 דקות כדי להסיר את ההתנגדות לאור שנחשפה. שטפו את הדגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Ce). חרט את ה- PaC עם חריטת יונים תגובתית כדי לפתוח את פני השטח הפעילים של האלקטרודות (160 W, 24 דקות, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). בדקו במיקרוסקופ שאין שאריות PaC על פני השטח הפעילים (איור 1Cf). הסר את photoresist הנותרים עם אצטון, לשטוף עם isopropanol ולייבש את הדגימות עם אקדח אוויר. הפעל את פני השטח של הדגימות באמצעות טיפול פלזמה חמצן במשך 90 s (100 W, 50 sccm). ערבבו פיזור מסחרי של PEDOT:PSS שעבר פולימור כימי עם 5% אתילן גליקול (EG), ו-0.1% נפח של חומצה סולפונית דודצילבנזן (DBSA). סוניק למשך 15 דקות. מוסיפים 1 wt% של (3-glycydyloxypropyl) trimethylsiloxane (GOPS) ו sonicate במשך 5 דקות. סנן את התמיסה דרך מסנן 1.2 מיקרומטר.אזהרה: EG הוא חומר מגרה ומהווה סכנה בריאותית. DBSA הוא מגרה וקורוזיבי. GOPS הוא מאכל. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים ולטפל בכימיקלים אלה מתחת למכסה מנוע.הערה: אמצעי האחסון הכולל תלוי במספר הדגימות. עבור 10 שקופיות זכוכית סטנדרטיות, להכין לפחות 20 מ”ל כי יהיה להתאים את הכמויות הבאות: 18.78 מ”ל של PEDOT:PSS, 1 מ”ל של EG, 20 μL של DBSA, ו 200 μL של GOPS. ציפוי ספין ארבע שכבות של תמיסת PEDOT:PSS במהירות של 150 x גרם למשך 35 שניות. לאחר שקיעת כל שכבה, אפו את הדגימות בטמפרטורה של 110°C במשך 60 שניות על צלחת חמה וקררו אותן לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני שתסובבו את השכבה הבאה (איור 1Cg). הסירו את שכבת ה-PaC המקריבה על-ידי טבילת הדגימות במים (איור 1Ch). אופים את הדגימות ב 140 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. טבלו את הדגימות במים שעברו דה-יוניזציה במשך 30 דקות כדי להסיר את שאריות הסבון והתרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך בסרט PEDOT:PSS ולנתק דגימות ממצע הזכוכית (איור 1Ci). חיבורים ואריזות (איור 1D)הניחו שכבה דקה של צבע אקרילי על סרט פולימיד המצופה נחושת (איור 1Da). השתמשו בתרסיס כדי לקבל שכבת צבע הומוגנית (איור 1Db). עצבו את הצבע האקרילי בלייזר (75 קילוהרץ, 7 ואט, מעבר לייזר אחד, 400 מ”מ·s-1) לקבלת שני רפידות מגע מלבניות (5 מ”מ x 15 מ”מ; מרווח של 1.5 מ”מ) (איור 1Dc). יש להרטיב את הנחושת עם ברזל כלוריד רווי של 30% (FeCl3) במים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40°C (איור 1Dd).זהירות: FeCl3 הוא חומר מגרה וקורוזיבי; טפלו בו עם כפפות מתחת למכסה מנוע. הפשיטו את צבע האקריליק עם אצטון על-ידי שפשוף קל שלו עם מטלית (איור 1De). חתכו את סרט הפולימיד המעוצב לצורות מלבניות (15 מ”מ x 30 מ”מ) באמצעות לייזר (15 קילוהרץ, 10 ואט, 30 מעברי לייזר, 130 מ”מ·s-1) (איור 1Df). הוציאו משחת כסף עם מכונת ניפוק תלת-צירית בלחץ של שלושה ברים עם מחט בקוטר 330 מיקרומטר (5 מ”ק-1) (איור 1Dg).זהירות: משחת כסף היא חומר מגרה; ידית עם כפפות. ישרו וחברו את הגשושית PaC עם סרט הפולימיד תחת מיקרוסקופ דו-עיני באמצעות פינצטה (איור 1Dh).הערה: ניתן לעצב סימני יישור בשלב 1.5.2 כדי להקל על מיקום הבדיקה על משטחי המגע. אופים בחום של 140 מעלות במשך שעתיים בתנור. הניחו סרט הגנה פולימידבגודל 1 ס”מ 2 על רפידות המגע (איור 1Di). טבלו את הממשק שבו הגשושית PaC וסרט הפולימיד מחוברים ב-PDMS (איור 1Dj). אופים אותו במשך 2 שעות ב 50 מעלות צלזיוס. הסירו את סרט ההגנה כדי לפתוח את רפידות המגע (איור 1Dk).הערה: מיקרו-ייצור של התקנים במבחנה דומה, אך יש לדלג על שלבים 1.2.1, 1.3 ו-1.5. 2. דור של קו תאים יציבים Glioblastoma GCaMP6f ייצור Lentivirusבצלוחית בגודל 75 סמ”ר, תרבית קו תאים הנגזר מ-HEK 293T המותאם לייצור לנטי-וירוס ב-10 מ”ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל 4.5 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט בתוספת 10% סרום בקר עוברי ללא טטרציקלין (FBS), 100 יחידות·mL-1 של פניצילין ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין למשך 3 ימים לפחות עד למפגש של 80%. מוציאים את המדיום מהצלוחית. שטפו בעדינות את התאים עם 10 מ”ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). הוסף 1 מ”ל של 0.25% תמיסת טריפסין/EDTA ודגר על הבקבוק במשך 5 דקות ב 37 ° C.זהירות: תמיסת טריפסין/EDTA מהווה סכנה בריאותית; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. הוסף 8 מ”ל של מדיום תרבות. שטפו בעדינות את מתלה התא. לספור את התאים צלחת 4 x 106 תאים בצלחת פטרי ב 8 מ”ל של מדיום תרבית. למחרת, לדלל 25 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את הגן GCaMP6f וסמן בחירה המקנה עמידות לפורומיצין בנפח כולל של 600 מיקרוליטר מים. הוסף אותו לצינור של מגיב טרנספקציה. מערבלים במשך 10 שניות ב-3,000 סל”ד ודוגרים על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר ייצור ננו-חלקיקים. מוסיפים את תכולת הצינור טיפתית על תרבית תאי HEK 293 T ומתנדנדים בעדינות ביד. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 4 שעות לפחות. החלף את המדיה המכילה קומפלקסים של ננו-חלקיקים במדיה טרייה והחזיר את התאים בטמפרטורה של 37°C. שלושה ימים לאחר מכן, לאסוף את supernatant ואת הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר פסולת סלולרית. אספו את השלב הנוזלי המכיל חלקיקים נגיפיים.הערה: ניתן לאשר את ייצור הנגיף בסופרנאטנט באמצעות בדיקת טיטר לנטיויראלי כמותי וניתן לאחסן אותו ב -80 ° C למשך שנתיים לפחות. התמרה של תאי גליובלסטומהבצלוחית בגודל 75 סמ”ר, תרבית תאי גליובלסטומה ב-10 מ”ל DMEM המכילים 1 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט בתוספת 10% FBS ללא טטרציקלין, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין למשך 4 ימים לפחות. השליכו את התווך והוסיפו את הסופרנאטנט שהתקבל בשלב 2.1.9 על תאי היעד. הוסף 5 מיקרוגרם·מ”ל-1 של הקסדימתרין ברומיד בתווך כדי לשפר את ההתמרה. לדגור במשך 6 שעות ב 37 ° C. החלף את המדיום עם 10 מ”ל של מדיום טרי.זהירות: הקסדימתרין ברומיד הוא חומר מגרה. טפל בזה עם כפפות. יצירת קו תאים יציביומיים עד שלושה לאחר הטרנסדוקציה, להוסיף 10 מ”ל של DMEM המכיל 1 גרם · L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, 10% FBS, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, 100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין בתוספת פורומיצין כדי להרוג את התאים שאינם מותמרים. תאי תרבית במדיה זו לפחות 3 ימים.זהירות: פורומיצין הוא חומר מגרה; טפל בו עם כפפות.הערה: רגישות של תאים לפורומיצין חייבת להיבדק לפני התמרה על ידי תרבית תאים בתווך המומלץ שלהם המכיל ריכוזים שונים של פורומיצין. יום לאחר מכן, בדוק את התאים עם מיקרוסקופ. בחר את הריכוז המתאים שבו רוב התאים מתים אך מעטים עדיין חיים, כדי להבטיח שהאנטיביוטיקה אינה רעילה מדי ועלולה להרוג גם את התאים הנגועים. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מ”ל של PBS. הוסיפו 1 מ”ל של 0.25% מתמיסת טריפסין/EDTA ודגרו על הבקבוק במשך 5 דקות ב-37°C. הוסף 8 מ”ל של מדיום תרבות. שטפו בעדינות את מתלה התא. אספו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ומדדו את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים. שאפו 50 μL של מתלה תאים במונה תאים אוטומטי ידני עם חיישן 60 מיקרומטר. זרעו תא אחד / באר בצלחת של 96 בארות. לדוגמה, עבור ריכוז של 1 x 10 3 תאים לכל מ”ל, להוסיף 1 / (1 x 103), כלומר, 0.001 מ”ל של השעיית תאים לכל באר. זרעו כל באר כדי להגדיל את סיכויי ההצלחה. להשלים עם מדיום תרבית כדי להגיע לנפח כולל של 200 μL לכל באר. יום לאחר מכן, מצא כל באר המכילה תא אחד ובדוק את הפלואורסצנטיות שלה (λexc = 490 ננומטר ו- λem = 530 ננומטר). סמן את הבארות המכילות תא נגוע אחד בלבד. ממשיכים את הצמיחה במשך כמה ימים עד שהבאר כמעט מתמזגת. השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 200 מיקרוליטר של PBS. הוסף 100 μL של תמיסת 0.25% טריפסין/EDTA ודגר על צלחת 96 בארות במשך 5 דקות ב 37 ° C. מוסיפים 100 μL של מדיום ושוטפים בעדינות את מתלה התא. מעבירים את תרחיף התא בצלחת פטרי. מוסיפים 5 מ”ל של מדיום ונותנים לתאים לגדול במשך כמה ימים עד צלחת פטרי הוא כמעט confluent. השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 5 מ”ל PBS. הוסיפו 1 מ”ל של תמיסת טריפסין/EDTA 0.25% ודגרו על צלחת הפטרי למשך 5 דקות ב-37°C. מוסיפים 6 מ”ל בינוני ושוטפים בעדינות את מתלה התא. העבר את מתלה התא לצלוחית T25. ממשיכים את הצמיחה במשך כמה ימים עד שהבקבוק כמעט מתמזג. השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 5 מ”ל PBS. הוסף 1 מ”ל של תמיסת טריפסין/EDTA 0.25% ודגר על בקבוק T25 למשך 5 דקות ב-37°C. הוסף 7 מ”ל DMEM המכיל 1 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, בתוספת 10% FBS, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין. שטפו בעדינות את מתלה התא. פצלו את מתלה התא לארבע צלוחיות T25 (2 מ”ל לכל צלוחיות) והוסיפו 5 מ”ל בינוני לכל בקבוק. תן לתאים לגדול במשך כמה ימים עד צלוחיות כמעט נפגשים. חזור על שלב 2.3.12 עבור שלוש צלוחיות ושמור את הבקבוק האחרון לשלב 3.1.3. העבר את מתלה התא בצינור חרוטי 15 מ”ל וצנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-900 μL. ערבבו בעדינות את התאים כדי לשמור על תרחיף תאים הומוגני. העבירו את תרחיף התא לבקבוקוני אחסון קריוגניים. הוסף 100 μL של dimethyl sulfoxide. מניחים את cryovials על -80 °C למשך הלילה. העברת תאים קפואים לחנקן נוזלי לניסויים נוספים.הערה: ניתן להעריך את יעילות הטרנספקציה על ידי הוספת מלח סידן יונומיצין 5 מיקרומטר בתווך ובדיקת העלייה המושרה של פלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (λexc = 490 ננומטר ו- λem = 530 ננומטר). 3.3D דגמים תרבית ספרואידיםהכינו תמיסה של 1% (w/v) אגרוז במים שעברו דה-יוניזציה (DI).מוסיפים 100 גרם אבקת אגרוז ב 100 מ”ל מים DI ומחממים את התמיסה בתנור מיקרוגל עד שכל האבקה מומסת. ערבבו את התמיסה באופן קבוע כדי למנוע גושים. Autoclave הפתרון במשך 20 דקות ב 120 ° C. לאחר שנלקח מן autoclave, להוסיף 75 μL של תמיסת agarose לכל באר צלחת 96 באר בזהירות. הפקידו אותו בצד הבאר כדי ליצור מניסקוס, וכתוצאה מכך תחתית עגולה לא דבקה. תן לו להתמצק במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. נתק את התאים (שלב 2.3.12) מהבקבוק שהתקבל בשלב 2.3.14. הוסף 10,000 תאים לכל באר של תאי גליובלסטומה והשלם כדי להגיע לנפח כולל של 150 μL לכל באר עם DMEM המכיל 1 גרם · L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 יחידות·mL-1 של פניצילין ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין. לדגור על תאים ב 37 ° C מבלי להזיז את הצלחת במשך 3 ימים. לאחר מכן, החליפו מחצית מהמדיה במדיה טרייה כל יומיים בפיפט רב ערוצי עד לניסויים נוספים. שמור את קצה פיפטה בחלק העליון של הבאר כדי למנוע נזק agarose או spheroid עצמו.הערה: גודל הספרואידים תלוי במספר התאים שנזרעו ובקו התא, ולכן יש להתאים אותו בהתאם לניסויים. מודל in ovo מניחים ביצים מופרות של שליו יפני (C. japonica) באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-57% לחות) על מגשים עם מסובב אוטומטי שמסובב ביצים כל שעתיים. יום זה נחשב ליום העובר (ED) 0. שטפו סירות שקילה מפלסטיק על ידי הכנסתן לאתנול 70% (w/v). הוציאו את סירות השקילה וייבשו אותן תחת מכסה אדים.הערה: מנקודה זו, ניסויים אינם מבוצעים בתנאים סטריליים. עם זאת, תנאים נקיים נדרשים כדי למנוע התפתחות של עובש על העוברים. ב-ED3, פתחו בעדינות את הביצים באמצעות פינצטה עם קצוות דקים שטופים מראש עם אתנול 70% (w/v). יוצקים את העובר לסירת שקילה מפלסטיק, מכסים אותו בסירת שקילה נוספת ומניחים אותו באינקובטור לח סטנדרטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. על ED6, לעשות חתך קטן בקרום chorioallantoic (CAM) עם מחט 23 גרם. בעזרת פיפטה מניחים ספרואיד 7 ימים על החתך, ומחזירים את העובר לאינקובטור למשך 3 ימים, עד לניסויים נוספים.הערה: ניתן להזריק צבע פלואורסצנטי לעין העובר כדי להמחיש כלי דם. ביום הניסוי, הניחו את הגשושית הגמישה על גבי הגידול הווסקולרי באמצעות מיקרומניפולטור. ה in vivo מודלהערה: חלק זה של הפרוטוקול מותאם מזה שפורסם בעבר בהפניה14. נעשה שימוש בעכברי AMU-Neuroinflam פלואורסצנטיים צבעוניים בוגרים (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); עכברים אלה מציגים תיוג של תת-אוכלוסייה של Thy1+ נוירונים על ידי ביטוי מהונדס של ECFP, תיוג של LyzM היקפי+ תאים דלקתיים על ידי ביטוי מהונדס של EGFP ותיוג של תת-סוג של מיקרוגליה המבטא EYFP תחת שליטה של Cd11c+. בקצרה, בעלי החיים מורדמים קלות עם 1.5% איזופלורן למשך 2 דקות לפני כל טיפול או הזרקה. לפני הניתוח מרדימים את בעלי החיים בקטמין (120 מ”ג/ק”ג; IP) וקסילזין (12 מ”ג/ק”ג; IP). לאחר מכן, 3% לידוקאין ג’ל מוחל באופן מקומי כדי להקל על כל כאב באוזניים הקשורים קיבוע של תמיכה סטריאוטקטית. לאחר מכן, 0.25% פתרון Bupivacaine מנוהל לאתר הניתוח כדי להקל על כל כאב עקב craniotomy. לאחר הכנת העכבר לניתוח, בוצעה קרניוטומיה בקוטר 4 מ”מ על פי הפניה14. עם מחט 26 גרם, חור נעשה dura-mater באמצע craniotomy ואת spheroid הגידול הוזרק עם מערכת ההזרקה המתוארת בהתייחסות14. בנוסף, כפי שמתואר כאן, אלקטרודה גמישה הונחה על GCamp6 או DsRed המבטא ספרואיד גידול לפני אטימת הקרניוטומיה עם חלון זכוכית.מניחים טיפה של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) כך שהוא מכסה את craniotomy. הניחו את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS, והניחו בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות מגע על גב העכבר (איור 4B).הערה: השתמש בכפפות סטריליות ובטכניקת “טיפ בלבד”. החליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי. ספק תמיכה תרמית במהלך הליך זה. גע בצניחת DPBS עם פיסת נייר קטנה כדי לספוג DPBS עד שהגשושית יכולה לשכב שטוחה על הדורה ולעקוב אחר העקמומיות של המוח. ודא ששכבה קטנה של DPBS נשארת מתחת לאלקטרודות מבלי לברוח מהצד של האלקטרודה. זה מבטיח מחסום מפני זליגת דבק במהלך השלבים הבאים.הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. הניחו טיפה קטנה של דבק סיליקון על הגשושית וכסו אותה בזכוכית כיסוי עגולה בקוטר 5 מ”מ. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה עד שהסיליקון מפוזר באופן שווה והמרחק בין זכוכית הכיסוי לבדיקה הוא מינימלי. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה למשך 30 שניות נוספות כדי שהסיליקון יוכל להתמצק. כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, מרחו במהירות דבק-על על צדדיה ודחפו אותה כלפי מטה עד שהדבק יתאחז למוצק. בעזרת קיסם, מרחו דבק-על על צוואר הגשושית ודאגו שדבק-העל יישאב מתחת לצוואר כדי לספק תמיכה יציבה עבורו. כסו את הגולגולת במלט דנטלי כדי לבנות כובע כרוני. יש להקפיד במיוחד לכסות את שולי זכוכית הכיסוי בלבד. הרימו את החלק האחורי של הגשושית ומרחו מלט מתחת לצוואר הבדיקה. הניחו את הגשושית על המלט לפני שהוא נרפא. דחפו את צוואר הגשושית בעדינות עם מלקחיים קהים כך שפני השטח שלה יהיו באותה רמה כמו זו של זכוכית הכיסוי ולא בדרך של מטרת המיקרוסקופ במהלך הניסוי. כסו את החלק העליון של צוואר הבדיקה בלא יותר מ-1.5 מ”מ של שכבת מלט דנטלי כדי להשיג אחיזה איתנה בבדיקה. בנו באר צמנט המציגה רכס של 1.5 מ”מ במרחק של 1-2 מ”מ סביב זכוכית הכיסוי כדי ליצור אגן עבור נוזל הטבילה עבור הדמיה של שני פוטונים (איור 4C). לאחר שהמלט נרפא, החל משככי כאבים לאחר ניתוח buprenorphine (0.05 מ”ג / ק”ג, 0.1 מ”ל לכל 10 גרם של משקל גוף תת עורית) ולשמור על החיה באווירה חמה עד שהוא מתעורר. זה כולל קרבה לנורת אינפרא אדום, כמו גם לעטוף את החיה במגבת נייר.הערה: מקם מדחום בגובה העכבר כדי לפקח על הטמפרטורה. אפיין עכבה בטווח של 1-10 קילוהרץ באמצעות פוטנציוסטט. תן לחיה להתאושש מהניתוח לפחות 10 ימים. לתת תרופות אנטי דלקתיות מיד לאחר הניתוח ולהמשיך לעקוב אחר מצב החיה כדי לספק משככי כאבים מתאימים לאחר הניתוח. 4. העברה והדמיה של שדה חשמלי פועם (PEF) הניחו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במקרה של מודלים תלת ממדיים, גידולים ניתן לראות רק מלמעלה.הערה: עבור מודל in ovo , ניסויים בוצעו תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (אך אפשרי גם במיקרוסקופ של שני פוטונים), בעוד שהניסויים במודל in vivo בוצעו תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים (איור 6). חברו מחולל פולסים לכריות המגע של המכשירים באמצעות מחברי פין פוגו (in vitro) או קליפסים של תנינים (in ovo ו-in vivo) (איור 4A). הגדר את הפרמטרים הרצויים (מספר פולסים, מתח, משך פולס, תדר) והפעל PEFs על-ידי הפעלת הגנרטור (איור 4A). מדוד פלואורסצנטיות בו זמנית כדי לבחון את ההשפעות של PEFs בזמן אמת.