Flexible organische elektronische Bauelemente für die gepulste elektrische Feldtherapie des Glioblastoms

Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit der französischen Gesetzgebung und in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 24. November 1986 (86/609/EWG) über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Tierforschung wurde von der Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône genehmigt und von der Ethikkommission der Provence Côte d’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054) genehmigt. 1. Mikrofabrikation flexibler Geräte (Abbildung 1) Reinigung der ObjektträgerGlasobjektträger in 2%iger Seifenlösung 15 Minuten lang beschallen. Spülen Sie sie mit Wasser ab. Erneut in einer Mischung aus 80% reinem Aceton und 20% reinem Isopropanol für 15 min beschallen.ACHTUNG: Diese Lösungsmittel sind schädlich und brennbar. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) und behandeln Sie diese unter einem Abzug. Spülen Sie die Objektträger mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Aceton während des gesamten Vorgangs nicht auf den Substraten trocknet. Goldelektroden-Strukturierung (Abbildung 1A)Scheiden Sie eine 3 μm dicke Schicht aus Parylene-C (PaC) mit einem Parylene-Abscheidungssystem ab (Abbildung 1Aa).Legen Sie die gereinigten Objektträger in die Abscheidekammer. Sprühen Sie Seife auf den Kühler, lassen Sie ihn trocknen und führen Sie ihn in die dafür vorgesehene Kühlfalle des Ablagerungssystems ein. Dieses Antiadhäsivmittel erleichtert das Entfernen von PaC aus dem Kühler nach der Abscheidung.ACHTUNG: PaC ist reizend und stellt ein Gesundheitsrisiko dar. Tragen Sie beim Umgang mit Handschuhen. Wiegen Sie 6 g PaC in einem Aluminiumschiffchen und legen Sie es in den Ofen. Evakuieren Sie die Maschine (P = 10 mTorr) und starten Sie die Abscheidung mit den folgenden Parametern:T-Kühler = -100 °C,T-Ofen = 690 °C,T-Verdampfer = 175 °C undT-Kammer = 135 °C. Wenn die Abscheidung beendet ist und die Temperatur des Verdampfers unter 40 °C liegt, schalten Sie den Kühler, den Verdampfer und den Ofen aus. Entlüften Sie die Maschine und sammeln Sie die Proben. Aktivieren Sie die Oberfläche der Proben durch Sauerstoffplasmabehandlung für 30 s (100 W, 50 sccm). Schleudern Sie die mit Plasma behandelten Proben mit einem negativen Fotolack bei 1.000 x g für 40 s. Die Proben werden 2 Minuten lang bei 110 °C auf eine Heizplatte gelegt (Abbildung 1Ab).VORSICHT: Die Fotolacklösung ist brennbar und verursacht Reizungen; Tragen Sie PSA und behandeln Sie sie unter einem Abzug. Platzieren Sie einen i-Linienfilter in der Strahllinie des UV-Breitband-Kontaktaligners und belichten Sie den Fotolack durch eine Maske, die das Design der interdigitalisierten Elektrode aufweist (Abbildung 1Ac).HINWEIS: Interdigitalisierte Elektroden mit einem Abstand von 50 oder 250 μm wurden mit einem Layout-Editor entworfen und Fotomasken wurden bei einem Unternehmen bestellt, das Polyester-Fotomasken durch Laser-Photoplotten herstellt. Die oben genannten Proben bei 110 °C auf einer heißen Platte 3 min backen und 5 min auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Tauchen Sie die Proben 3 Minuten lang in einen metallionenfreien Entwickler, um den nicht belichteten Fotolack zu entfernen. Spülen Sie die Proben mit Wasser ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole (Abbildung 1Ad).VORSICHT: Die Entwicklerlösung ist irritierend; Tragen Sie PSA und Griff unter einem Abzug. Aktivieren Sie die Oberfläche der Proben durch Sauerstoffplasmabehandlung für 60 s (100 W, 50 sccm). Scheiden Sie eine 20 nm Haftschicht aus Chrom und eine 300 nm Schicht aus Gold mit einem thermischen Verdampfer wie folgt ab (Abbildung 1Ae). Entlüften Sie die Verdampfermaschine und befestigen Sie die Proben (mit der Vorderseite nach unten) mit Metallschrauben an der oberen runden Platte. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Tiegel mit Chrom bzw. Gold. Versiegeln und evakuieren Sie die Maschine, um einen Druck unter 5·10-6 Torr zu erreichen. Starten Sie die Drehung des Probenhalters. Wählen Sie den chromhaltigen Tiegel und erhöhen Sie langsam den Strom, der durch ihn fließt, bis eine Abscheidungsrate von 0,2 Å·s-1 erreicht ist. Öffnen Sie den Verschluss und warten Sie, bis 20 nm Chrom abgeschieden sind. Schließen Sie den Verschluss und drosseln Sie den Strom langsam auf 0 mA. Wählen Sie den Tiegel mit Gold aus und erhöhen Sie langsam den Strom, der durch ihn fließt, bis eine Abscheidungsrate von 0,2 Å·s-1 erreicht ist. Öffnen Sie den Verschluss, um Gold zu verdampfen, warten Sie, bis 10 nm Gold abgelagert sind, und erhöhen Sie dann die Abscheidungsrate auf 1,5 Å·s-1 , bis etwa 300 nm abgelagert sind. Schließen Sie den Verschluss und drosseln Sie den Strom langsam auf 0 mA. Lassen Sie die Proben nach der Ablagerung 15 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Stoppen Sie die Drehung des Probenhalters, entlüften Sie die Maschine und sammeln Sie die Proben. Tauchen Sie die Proben in ein Becherglas mit Aceton. Stellen Sie das Becherglas 15 Minuten lang auf eine Schüttelplatte, die auf 110 U/min eingestellt ist, um den Fotolack abzuheben. Spülen Sie die Proben mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole (Abbildung 1Af). Aktivieren Sie die Oberfläche der Proben durch Sauerstoffplasmabehandlung für 30 s (100 W, 50 sccm). Abscheidung einer 3 μm dicken Isolationsschicht aus PaC mit einem Parylene-Abscheidungssystem (siehe Schritt 1.2.1) (Abbildung 1Ag). Umrissöffnung (Abbildung 1B)Schleudern Sie die Proben mit einem positiven Fotolack bei 600 x g für 35 s. Legen Sie es für 2 min auf eine Kochplatte bei 110 °C (Abbildung 1Ba).VORSICHT: Die Fotolacklösung ist brennbar und verursacht Reizungen; Tragen Sie PSA und Griff unter einem Abzug. Stellen Sie sicher, dass sich kein i-Linienfilter in der Strahllinie des UV-Breitband-Kontaktaligners befindet, und belichten Sie den Fotolack durch eine Maske, die den Umriss des Geräts mit einem UV-Breitband-Kontaktaligner aufweist (Abbildung 1Bb). Tauchen Sie die Proben 4 Minuten lang in einen metallionenfreien Entwickler, um den belichteten Fotolack zu entfernen. Spülen Sie die Proben mit Wasser ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole (Abbildung 1Bc). Der Umriss wird mit einem reaktiven Ionenätzer (160 W, 22 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) durch die beiden PaC-Schichten geätzt (Abbildung 1Bd). Entfernen Sie den restlichen Fotolack mit Aceton, spülen Sie ihn mit Isopropanol ab und trocknen Sie die Proben mit einer Luftpistole. PEDOT:PSS-Beschichtung (Abbildung 1C)Eine 2%ige Seifenlösung wird 35 s lang bei 70 x g geschleudert (Abbildung 1Ca). Abscheidung einer 3 μm großen Opferschicht aus PaC mit einem Parylene-Abscheidungssystem (siehe Schritt 1.2.1) (Abbildung 1Cb). Spin-Coat-positiver Fotolack bei 600 x g für 35 s. Legen Sie die Proben für 2 min auf eine Heizplatte bei 110 °C (Abbildung 1 Cc). Stellen Sie sicher, dass sich kein i-Linienfilter in der Strahllinie des UV-Breitband-Kontaktaligners befindet, und belichten Sie den Fotolack durch eine Maske, die die aktive Oberfläche der Elektroden aufweist (Abbildung 1Cd). Tauchen Sie die Proben 4 Minuten lang in einen metallionenfreien Entwickler, um den belichteten Fotolack zu entfernen. Spülen Sie die Proben mit Wasser ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole (Abbildung 1Ce). Ätzen Sie den PaC mit einem reaktiven Ionenätzer, um die aktive Oberfläche der Elektroden zu öffnen (160 W, 24 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sich kein Rest-PaC auf der aktiven Oberfläche befindet (Abbildung 1Cf). Entfernen Sie den restlichen Fotolack mit Aceton, spülen Sie ihn mit Isopropanol ab und trocknen Sie die Proben mit einer Luftpistole. Aktivieren Sie die Oberfläche der Proben mit einer Sauerstoffplasmabehandlung für 90 s (100 W, 50 sccm). Mischen Sie eine handelsübliche Dispersion von chemisch polymerisiertem PEDOT:PSS mit 5 Vol.-% Ethylenglykol (EG) und 0,1 Vol.-% Dodecylbenzolsulfonsäure (DBSA). 15 Minuten einwirken lassen. 1 Gew.-% (3-Glycydyloxypropyl)trimethylsiloxan (GOPS) zugeben und 5 Minuten lang beschallen. Filtern Sie die Lösung durch einen 1,2 μm Filter.ACHTUNG: EG ist reizend und stellt eine Gesundheitsgefahr dar. DBSA ist reizend und ätzend. GOPS ist ätzend. Tragen Sie geeignete PSA und behandeln Sie diese Chemikalien unter einem Abzug.HINWEIS: Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der Proben ab. Bereiten Sie für 10 Standard-Objektträger mindestens 20 ml vor, die den folgenden Mengen entsprechen würden: 18,78 ml PEDOT:PSS, 1 ml EG, 20 μl DBSA und 200 μl GOPS. Vier Schichten PEDOT:PSS-Lösung bei 150 x g 35 s lang schleudern. Nach der Abscheidung jeder Schicht werden die Proben 60 s lang bei 110 °C auf einer heißen Platte gebacken und 5 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt, bevor die nächste Schicht geschleudert wird (Abbildung 1Cg). Entfernen Sie die Opfer-PaC-Schicht, indem Sie die Proben in Wasser tauchen (Abbildung 1Ch). Die Proben bei 140 °C 1 h backen. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang in deionisiertes Wasser, um die verbleibende Seife und niedermolekulare Verbindungen in der PEDOT:PSS-Folie zu entfernen und die Proben vom Glassubstrat zu lösen (Abbildung 1Ci). Anschlüsse und Gehäuse (Abbildung 1D)Tragen Sie eine dünne Schicht Acrylfarbe auf eine Polyimidfolie auf, die mit Kupfer beschichtet ist (Abbildung 1Da). Verwenden Sie ein Aerosol, um eine homogene Farbschicht zu erhalten (Abbildung 1Db). Mustern Sie die Acrylfarbe mit einem Laser (75 kHz, 7 W, 1 Laserdurchgang, 400 mm·s-1), um zwei rechteckige Kontaktflächen (5 mm x 15 mm; 1,5 mm Abstand) zu erhalten (Abbildung 1Dc). Nassätzen Sie das Kupfer mit gesättigtem 30 % (w/v) Eisenchlorid (FeCl3) in Wasser für 15 min bei 40 °C (Abbildung 1Dd).VORSICHT: FeCl3 ist reizend und ätzend; Fassen Sie es mit Handschuhen unter einem Abzug an. Entfernen Sie die Acrylfarbe mit Aceton, indem Sie sie leicht mit einem Tuch abreiben (Abbildung 1De). Schneiden Sie die gemusterte Polyimidfolie mit einem Laser (15 kHz, 10 W, 30 Laserdurchgänge, 130 mm·s-1) in rechteckige Formen (15 kHz, 10 W, 130 mm·s-1) (Abbildung 1Df). Dosieren Sie Silberpaste mit einer dreiachsigen Dosiermaschine bei einem Druck von drei bar mit einer Nadel mit einem Durchmesser von 330 μm (5 m·min-1) (Abbildung 1Dg).VORSICHT: Silberpaste ist reizend; mit Handschuhen anfassen. Richten Sie die PaC-Sonde mit einer Pinzette aus und befestigen Sie sie mit der Polyimidfolie unter einem binokularen Mikroskop (Abbildung 1Dh).HINWEIS: Ausrichtungsmarkierungen können in Schritt 1.5.2 gemustert werden, um die Positionierung der Sonde auf den Kontaktflächen zu erleichtern. Bei 140 °C 2 h im Ofen backen. Legen Sie ein 1 cm2 Polyimid-Schutzband auf die Kontaktpads (Abbildung 1Di). Tauchen Sie die Schnittstelle, an der die PaC-Sonde und die Polyimidfolie angeschlossen sind, in PDMS ein (Abbildung 1Dj). 2 h bei 50 °C backen. Entfernen Sie das Schutzband, um die Kontaktpads zu öffnen (Abbildung 1Dk).HINWEIS: Die Mikrofabrikation von In-vitro-Produkten ist ähnlich, aber die Schritte 1.2.1, 1.3 und 1.5 müssen übersprungen werden. 2. Generierung einer stabilen Glioblastom-GCaMP6f-Zelllinie Lentivirus-ProduktionIn einem 75 cm² großen Kolben wird eine von HEK 293T abgeleitete Zelllinie, die für die Lentivirus-Produktion optimiert ist, in 10 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 4,5 g· L-1 von Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat und ergänzt mit 10% tetracyclin-freiem fetalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten ·mL-1 Penicillin und 100 μg·mL-1 Streptomycin für mindestens 3 Tage bis 80% Konfluenz. Nehmen Sie das Medium aus dem Kolben. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 1 ml 0,25%ige Trypsin/EDTA-Lösung zugeben und den Kolben 5 min bei 37 °C inkubieren.VORSICHT: Trypsin / EDTA-Lösung stellt eine Gesundheitsgefahr dar; Tragen Sie PSA und Griff unter einem Abzug. Fügen Sie 8 ml Nährmedium hinzu. Spülen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Zählen Sie die Zellen und geben Sie 4 x 106 Zellen in einer Petrischale in 8 ml Nährmedium. Am nächsten Tag werden 25 μg des Plasmids, das das Gen GCaMP6f und einen Selektionsmarker enthält, der eine Resistenz gegen Puromycin verleiht, in einem Gesamtvolumen von 600 μl Wasser verdünnt. Geben Sie es in ein Röhrchen mit Transfektionsreagenz. Wirbeln Sie 10 s lang bei 3.000 U / min und inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um die Produktion von Nanopartikeln zu ermöglichen. Den Inhalt des Röhrchens tropfenweise auf die Kultur der HEK 293 T-Zellen geben und vorsichtig von Hand schütteln. Die Zellen werden mindestens 4 h lang bei 37 °C inkubiert. Ersetzen Sie die Medien, die Nanopartikelkomplexe enthalten, durch frische Medien und geben Sie die Zellen bei 37 °C zurück. Sammeln Sie den Überstand drei Tage später und zentrifugieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 500 x g , um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie die flüssige Phase, die Viruspartikel enthält.HINWEIS: Die Virusproduktion im Überstand kann mit einem quantitativen lentiviralen Titertest bestätigt werden und kann mindestens 2 Jahre bei -80 °C gelagert werden. Transduktion von GlioblastomzellenIn einem 75 cm² großen Kolben werden Glioblastomzellen in 10 ml DMEM mit 1 g· L-1 von Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat und ergänzt mit 10% Tetracyclin-freiem FBS, 100 Einheiten · mL-1 Penicillin und 100 μg · mL-1 Streptomycin für mindestens 4 Tage. Das Medium wird verworfen und der in Schritt 2.1.9 erhaltene Überstand auf die Zielzellen gegeben. Geben Sie 5 μg·mL-1 Hexadimethrinbromid in das Medium, um die Transduktion zu verbessern. 6 h bei 37 °C inkubieren. Ersetzen Sie das Medium durch 10 ml frisches Medium.ACHTUNG: Hexadimethrinbromid ist reizend. Behandeln Sie es mit Handschuhen. Generierung einer stabilen ZelllinieZwei bis drei Tage nach der Transduktion 10 ml DMEM mit 1 g· L-1 von Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, 10% FBS, 100 Einheiten ·mL-1 Penicillin, 100 μg·mL-1 von Streptomycin und ergänzt mit Puromycin, um die nicht transduzierten Zellen abzutöten. Kultivieren Sie die Zellen mindestens 3 Tage lang in diesem Medium.ACHTUNG: Puromycin ist reizend; Behandeln Sie es mit Handschuhen.HINWEIS: Die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Puromycin muss vor der Transduktion getestet werden, indem Zellen in ihrem empfohlenen Medium kultiviert werden, das unterschiedliche Konzentrationen von Puromycin enthält. Einen Tag später überprüfen Sie die Zellen mit einem Mikroskop. Wählen Sie die geeignete Konzentration, bei der die Mehrheit der Zellen tot ist, aber nur wenige noch am Leben sind, um sicherzustellen, dass das Antibiotikum nicht zu toxisch ist und auch die transfizierten Zellen töten könnte. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 ml PBS aus. 1 ml 0,25 % einer Trypsin/EDTA-Lösung zugeben und den Kolben 5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie 8 ml Nährmedium hinzu. Spülen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Sammeln Sie 100 μl Zellsuspension und messen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler. Saugen Sie 50 μl Zellsuspension in einem tragbaren automatisierten Zellzähler mit einem 60-μm-Sensor ab. Säen Sie 1 Zelle/Well in eine 96-Well-Platte. Zum Beispiel wird für eine Konzentration von 1 x 10 3 Zellen pro ml 1 / (1 x 103) addiert, d. h. 0,001 ml Zellsuspension pro Vertiefung. Säen Sie jeden Brunnen, um die Erfolgschancen zu erhöhen. Komplett mit Nährmedium, um ein Gesamtvolumen von 200 μl pro Vertiefung zu erreichen. Einen Tag später finden Sie jede Vertiefung, die eine Zelle enthält, und überprüfen Sie ihre Fluoreszenz (λexc = 490 nm und λem = 530 nm). Markieren Sie die Vertiefungen, die nur eine transfizierte Zelle enthalten. Setzen Sie das Wachstum für einige Tage fort, bis der Brunnen fast zusammenfließt. Entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 200 μl PBS aus. 100 μl 0,25%ige Trypsin/EDTA-Lösung zugeben und die 96-Well-Platte 5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie 100 μl Medium hinzu und spülen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Petrischale. Fügen Sie 5 ml Medium hinzu und lassen Sie die Zellen einige Tage wachsen, bis die Petrischale fast zusammenfließt. Entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 5 ml PBS aus. 1 ml 0,25%ige Trypsin/EDTA-Lösung zugeben und die Petrischale 5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie 6 ml Medium hinzu und spülen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Die Zellsuspension wird in einen T25-Kolben überführt. Setzen Sie das Wachstum für einige Tage fort, bis der Kolben fast konfluiert ist. Entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 5 ml PBS aus. 1 ml 0,25%ige Trypsin/EDTA-Lösung zugeben und den T25-Kolben 5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie 7 ml DMEM hinzu, das 1 g· L-1 von Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat und ergänzt mit 10% FBS, 100 Einheiten · mL-1 Penicillin und 100 μg · mL-1 Streptomycin. Spülen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Teilen Sie die Zellsuspension auf vier T25-Kolben (2 ml pro Kolben) auf und geben Sie 5 ml Medium in jeden Kolben. Lassen Sie die Zellen einige Tage wachsen, bis die Kolben fast konfluierend sind. Wiederholen Sie Schritt 2.3.12 für drei Kolben und bewahren Sie den letzten Kolben für Schritt 3.1.3 auf. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und bei 150 x g 5 min zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 900 μl. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension in kryogene Lagerfläschchen. 100 μl Dimethylsulfoxid zugeben. Legen Sie die Kryozellen über Nacht bei -80 °C. Übertragen Sie gefrorene Zellen für weitere Experimente auf flüssigen Stickstoff.HINWEIS: Die Effizienz der Transfektion kann durch Zugabe von 5 μM Ionomycin-Calciumsalz in das Medium und Überprüfung des induzierten Fluoreszenzanstiegs unter einem Fluoreszenzmikroskop (λexc = 490 nm und λem = 530 nm) beurteilt werden. 3.3D Modelle Sphäroid-KulturBereiten Sie eine Lösung von 1% (w/v) Agarose in deionisiertem (DI) Wasser vor.100 g Agarosepulver in 100 ml DI-Wasser geben und die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich das gesamte Pulver aufgelöst hat. Rühren Sie die Lösung regelmäßig um, um Klumpen zu vermeiden. Die Lösung wird 20 Minuten lang bei 120 °C autoklaviert. Nach der Entnahme aus dem Autoklaven 75 μl Agaroselösung pro Vertiefung vorsichtig in eine 96-Well-Platte geben. Legen Sie es an der Seite des Brunnens ab, um einen Meniskus zu bilden, was zu einem nicht haftenden runden Boden führt. 15 Minuten bei Raumtemperatur erstarren lassen. Die Zellen (Schritt 2.3.12) werden von dem in Schritt 2.3.14 erhaltenen Kolben abgenommen. Fügen Sie 10.000 Zellen pro Vertiefung von Glioblastomzellen hinzu und vervollständigen Sie, um ein Gesamtvolumen von 150 μl pro Vertiefung mit DMEM zu erreichen, das 1 g· L-1 von Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat und ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten · mL-1 Penicillin und 100 μg · mL-1 Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C, ohne die Platte zu bewegen. Ersetzen Sie dann alle 2 Tage die Hälfte des Mediums durch frisches Medium mit einer Mehrkanalpipette, bis weitere Experimente durchgeführt werden. Halten Sie die Pipettenspitze im oberen Teil der Vertiefung, um eine Beschädigung der Agarose oder des Sphäroids selbst zu vermeiden.HINWEIS: Die Größe der Sphäroide hängt von der Anzahl der ausgesäten Zellen und der Zelllinie ab und muss daher je nach Experiment angepasst werden. Das In-ovo-Modell Legen Sie befruchtete Eier der japanischen Wachtel (C. japonica) in einen Brutkasten (37 °C und 57% Luftfeuchtigkeit) auf Tabletts mit einem automatischen Rotator, der die Eier alle 2 Stunden wendet. Dieser Tag gilt als Embryonaltag (ED) 0. Waschen Sie Kunststoff-Wiegeboote, indem Sie sie in 70% (w/v) Ethanol legen. Nehmen Sie die Wiegeboote heraus und trocknen Sie sie unter einem Abzug.HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt werden die Experimente nicht mehr unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Es sind jedoch saubere Bedingungen erforderlich, um die Entwicklung von Schimmel auf den Embryonen zu vermeiden. Öffnen Sie die Eier auf ED3 vorsichtig mit einer Pinzette mit dünnen Spitzen, die mit 70% (w/v) Ethanol vorgewaschen sind. Gießen Sie den Embryo in ein Plastikwiegeboot, decken Sie es mit einem anderen Wiegeboot ab und legen Sie ihn 3 Tage lang bei 37 °C in einen befeuchteten Standardinkubator. Machen Sie bei ED6 mit einer 23-G-Nadel einen kleinen Einschnitt in die Chorioallantoismembran (CAM). Legen Sie mit einer Pipette ein 7-Tage-Sphäroid auf den Schnitt und geben Sie den Embryo bis zu weiteren Experimenten für 3 Tage in den Inkubator zurück.HINWEIS: Ein Fluoreszenzfarbstoff kann in das Auge des Embryos injiziert werden, um Blutgefäße sichtbar zu machen. Platzieren Sie die flexible Sonde am Tag des Experiments mit einem Mikromanipulator auf dem vaskularisierten Tumor. Das in vivo ModellHINWEIS: Dieser Teil des Protokolls wurde von dem zuvor als Referenz veröffentlichten Teil angepasst14. Es wurden adulte mehrfarbige fluoreszierende AMU-Neuroinflam-Mäuse (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) verwendet; Diese Mäuse zeigen die Markierung einer Subpopulation von Thy1+ Neuronen durch transgene Expression von ECFP, Markierung von peripherem LyzM+ Entzündungszellen durch transgene Expression von EGFP und Markierung eines Subtyps von Mikroglia, die EYFP unter der Kontrolle von Cd11c exprimieren+. Kurz gesagt, die Tiere werden vor jeder Behandlung oder Injektion 2 Minuten lang leicht mit 1,5% Isofluran sediert. Vor der Operation werden die Tiere mit Ketamin (120 mg/kg; IP) und Xylazin (12 mg/kg; IP). Dann wird 3% Lidocain-Gel lokal aufgetragen, um Schmerzen in den Ohren zu lindern, die mit der Fixierung der stereotaktischen Unterstützung verbunden sind. Dann wird 0,25% ige Bupivacain-Lösung an die Operationsstelle verabreicht, um Schmerzen aufgrund der Kraniotomie zu lindern. Nachdem die Maus für die Operation vorbereitet war, wurde eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 4 mm gemäß Referenz durchgeführt14. Mit einer 26-G-Nadel wurde in der Mitte der Kraniotomie ein Loch in die Dura mater gebohrt und dem Tumorsphäroid das in der Referenz beschriebene Injektionssystem injiziert14. Zusätzlich wurde, wie hier beschrieben, eine flexible Elektrode auf das GCamp6- oder DsRed-exprimierende Tumorsphäroid gelegt, bevor die Kraniotomie mit einem Glasfenster versiegelt wurde.Geben Sie einen Tropfen Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) so auf, dass sie die Kraniotomie bedeckt. Setzen Sie die flexible Elektrode auf den Tropfen des DPBS und legen Sie die Rückseite der Sonde mit den Kontaktpads vorsichtig auf die Rückseite der Maus (Abbildung 4B).HINWEIS: Verwenden Sie sterile Handschuhe und eine “Nur-Tipp”-Technik. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine nicht sterile Oberfläche berührt wird. Sorgen Sie während dieses Vorgangs für thermische Unterstützung. Berühren Sie den DPBS-Tropfen mit einem kleinen Stück Papier, um DPBS zu absorbieren, bis die Sonde flach auf der Dura liegen und der Krümmung des Gehirns folgen kann. Stellen Sie sicher, dass eine kleine DPBS-Schicht unter den Elektroden verbleibt, ohne von der Seite der Elektrode zu entweichen. Dies gewährleistet eine Barriere gegen das Überlaufen von Klebstoff während der nächsten Schritte.HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch. Geben Sie einen kleinen Tropfen Silikonkleber auf die Sonde und decken Sie sie mit einem 5 mm runden Deckglas ab. Drücken Sie das Deckglas nach unten, bis das Silikon gleichmäßig verteilt ist und der Abstand zwischen dem Deckglas und der Sonde minimal ist. Drücken Sie das Deckglas für weitere 30 s nach unten, damit sich das Silikon verfestigen kann. Um das Deckglas zu befestigen, tragen Sie schnell Sekundenkleber auf die Seiten auf und drücken Sie ihn nach unten, bis der Kleber fest aushärtet. Tragen Sie mit einem Zahnstocher Sekundenkleber auf den Hals der Sonde auf und achten Sie darauf, dass der Sekundenkleber unter den Hals gezogen wird, um ihn stabil zu stützen. Decken Sie den Schädel mit Zahnzement ab, um eine chronische Kappe aufzubauen. Achten Sie besonders darauf, nur die Kanten des Deckglases abzudecken. Heben Sie die Rückseite der Sonde an und tragen Sie Zement unter den Sondenhals auf. Legen Sie die Sonde auf den Zement, bevor sie aushärtet. Drücken Sie den Hals der Sonde vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette nach unten, so dass sich ihre Oberfläche während des Experiments auf gleicher Höhe wie die des Deckglases befindet und nicht im Weg des Mikroskopobjektivs liegt. Decken Sie die Oberseite des Sondenhalses mit nicht mehr als 1,5 mm Zahnzementschicht ab, um einen festen Halt auf der Sonde zu erreichen. Bauen Sie einen Zementbrunnen mit einem 1,5 mm dicken Grat in einem Abstand von 1-2 mm um das Deckglas, um ein Becken für die Immersionsflüssigkeit für die Zwei-Photonen-Bildgebung zu schaffen (Abbildung 4C). Tragen Sie nach dem Aushärten des Zements postoperative Buprenorphin-Analgetika (0,05 mg/kg, 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht subkutan) auf und halten Sie das Tier bis zum Aufwachen in einer warmen Atmosphäre. Dazu gehört die Nähe zu einer Infrarot-Glühbirne sowie das Einwickeln des Tieres in ein Papiertuch.HINWEIS: Platzieren Sie ein Thermometer auf Höhe der Maus, um die Temperatur zu überwachen. Charakterisieren Sie die Impedanz im Bereich von 1-10 kHz mit einem Potentiostaten. Lassen Sie das Tier mindestens 10 Tage lang von der Operation erholen. Verabreichen Sie sofort nach der Operation entzündungshemmende Medikamente und überwachen Sie weiterhin den Zustand des Tieres, um eine angemessene postoperative Analgesie bereitzustellen. 4. Abgabe und Bildgebung von gepulsten elektrischen Feldern (PEF) Legen Sie die Proben unter ein Fluoreszenzmikroskop. Bei 3D-Modellen können Tumore nur von oben beobachtet werden.HINWEIS: Für das In-ovo-Modell wurden die Experimente unter einem Epifluoreszenzmikroskop durchgeführt (ist aber auch mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop möglich), während die Experimente am In-vivo-Modell unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop durchgeführt wurden (Abbildung 6). Schließen Sie einen Impulsgenerator an die Kontaktpads der Geräte an, indem Sie Pogo-Pin-Anschlüsse (in vitro) oder Krokodilklemmen (in Ovo und in vivo) verwenden (Abbildung 4A). Stellen Sie die gewünschten Parameter ein (Anzahl der Impulse, Spannung, Impulsdauer, Frequenz) und wenden Sie PEFs an, indem Sie den Generator laufen lassen (Abbildung 4A). Messen Sie gleichzeitig die Fluoreszenz, um die Auswirkungen der PEFs in Echtzeit zu beobachten.