Dispositifs électroniques organiques flexibles pour la thérapie par champs électriques pulsés du glioblastome

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément à la législation française et à la directive du Conseil de la Communauté européenne du 24 novembre 1986 (86/609/CEE) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La recherche sur les animaux a été autorisée par la Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône et approuvée par le comité d’éthique de Provence Côte d’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Microfabrication de dispositifs souples (figure 1) Nettoyage des lames de verreSonicate de verre glisse dans une solution de savon à 2% pendant 15 min. Rincez-les à l’eau. Soniquer à nouveau dans un mélange de 80% d’acétone pure et 20% d’isopropanol pur pendant 15 min.ATTENTION : Ces solvants sont nocifs et inflammables. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) et manipulez-le sous une hotte. Rincer les lames avec de l’isopropanol et sécher avec un pistolet à air.REMARQUE: Assurez-vous que l’acétone ne sèche pas sur les substrats pendant tout le processus. Motifs d’électrodes en or (Graphique 1A)Déposer une couche de 3 μm de parylène-C (PaC) avec un système de dépôt de parylène (Figure 1Aa).Placez les lames de verre nettoyées dans la chambre de dépôt. Vaporisez du savon sur le refroidisseur, laissez-le sécher et insérez-le dans le piège à froid désigné du système de dépôt. Cet anti-adhésif facilite l’élimination du PaC du refroidisseur après le dépôt.MISE EN GARDE : Le PaC est irritant et présente un danger pour la santé. Portez des gants lorsque vous le manipulez. Pesez 6 g de PaC dans un bateau en aluminium et placez-le dans le four. Évacuer la machine (P = 10 mTorr) et commencer le dépôt avec les paramètres suivants :Refroidisseur T = -100 °C, Four T = 690 °C,Vaporisateur T = 175 °Cet Chambre T = 135 °C. Lorsque le dépôt est terminé et que la température du vaporisateur est inférieure à 40 °C, éteignez le refroidisseur, le vaporisateur et le four. Ventilez la machine et prélevez les échantillons. Activer la surface des échantillons par traitement plasma à l’oxygène pendant 30 s (100 W, 50 sccm). Enduire les échantillons traités au plasma avec une résine photosensible négative à 1 000 x g pendant 40 s. Placer les échantillons sur une plaque chauffante à 110 °C pendant 2 min (figure 1Ab).ATTENTION : La solution de résine photosensible est inflammable et provoque une irritation ; porter l’EPI et le manipuler sous une hotte. Placez un filtre i-line dans la ligne de faisceau de l’aligneur de contact UV à large bande et exposez la résine photosensible à travers un masque présentant la conception de l’électrode interdigitée (Figure 1Ac).REMARQUE: Les électrodes interdigitées avec un espace de 50 ou 250 μm ont été conçues à l’aide d’un éditeur de mise en page et les photomasques ont été commandés à une entreprise qui produit des photomasques en polyester par phototraçage laser. Cuire les échantillons ci-dessus à 110 °C sur une plaque chauffante pendant 3 min et les laisser refroidir à température ambiante pendant 5 min. Immergez les échantillons dans un révélateur sans ions métalliques pendant 3 minutes pour retirer la résine photosensible non exposée. Rincer les échantillons à l’eau et les sécher à l’aide d’un pistolet à air comprimé (figure 1Ad).ATTENTION : La solution du développeur est un irritant ; porter l’EPI et manipuler sous une hotte. Activer la surface des échantillons par traitement plasma à l’oxygène pendant 60 s (100 W, 50 sccm). Déposer une couche d’adhérence de 20 nm de chrome et une couche d’or de 300 nm avec un évaporateur thermique comme suit (Figure 1Ae). Éventez l’évaporateur et clipsez les échantillons (vers le bas) sur la plaque ronde supérieure à l’aide de vis métalliques. Remplissez les creusets dédiés, respectivement, avec du chrome et de l’or. Sceller et évacuer la machine pour atteindre une pression inférieure à 5.10-6 Torr. Lancez la rotation du porte-échantillon. Sélectionnez le creuset contenant du chrome et augmentez lentement le courant qui le traverse jusqu’à ce qu’un taux de dépôt de 0,2 Å·s-1 soit atteint. Ouvrez l’obturateur et attendez que 20 nm de chrome soient déposés. Fermez l’obturateur et diminuez lentement le courant jusqu’à 0 mA. Sélectionnez le creuset contenant de l’or et augmentez lentement le courant qui le traverse jusqu’à ce qu’un taux de dépôt de 0,2 Å·s-1 soit atteint. Ouvrez l’obturateur pour évaporer l’or, attendez que 10 nm d’or soient déposés, puis augmentez le taux de dépôt à 1,5 Å·s-1 jusqu’à ce qu’environ 300 nm soient déposés. Fermez l’obturateur et abaissez lentement le courant à 0 mA. Laisser les échantillons refroidir à température ambiante pendant 15 minutes après le dépôt. Arrêtez la rotation du porte-échantillon, aérez la machine et prélevez les échantillons. Plongez les échantillons dans un bécher avec de l’acétone. Placer le bécher sur une plaque à secouer réglée à 110 tr/min pendant 15 min pour soulever la résine photosensible. Rincer les échantillons avec de l’isopropanol et les sécher avec un pistolet à air comprimé (figure 1Af). Activer la surface des échantillons par traitement plasma à l’oxygène pendant 30 s (100 W, 50 sccm). Déposer une couche isolante de 3 μm de PaC avec un système de dépôt de parylène (voir étape 1.2.1) (Figure 1Ag). Ouverture du contour (figure 1B)Enduire les échantillons d’une résine photosensible positive à 600 x g pendant 35 s. Placez-le sur une plaque chauffante à 110 °C pendant 2 min (figure 1Ba).ATTENTION : La solution de résine photosensible est inflammable et provoque une irritation ; porter l’EPI et manipuler sous une hotte. Assurez-vous qu’il n’y a pas de filtre i-line dans la ligne de faisceau de l’aligneur de contact UV large bande et exposez la résine photosensible à travers un masque qui présente le contour de l’appareil avec un aligneur de contact large bande UV (Figure 1Bb). Immergez les échantillons dans un révélateur sans ions métalliques pendant 4 minutes pour retirer la résine photosensible exposée. Rincez les échantillons à l’eau et séchez-les à l’aide d’un pistolet à air comprimé (figure 1Bc). Graver le contour à travers les deux couches de PaC avec une gravure ionique réactive (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figure 1Bd). Retirer la résine photosensible restante avec de l’acétone, rincer avec de l’isopropanol et sécher les échantillons avec un pistolet à air comprimé. PEDOT:revêtement PSS (Figure 1C)Enduire une solution de savon à 2 % à 70 x g pendant 35 s (Figure 1Ca). Déposer une couche sacrificielle de PaC de 3 μm avec un système de dépôt de parylène (voir étape 1.2.1) (Figure 1Cb). Résine photosensible positive spin-coat à 600 x g pendant 35 s. Placer les échantillons sur une plaque chauffante à 110 °C pendant 2 min (figure 1Cc). Assurez-vous qu’il n’y a pas de filtre i-line dans la ligne de faisceau de l’aligneur de contact UV à large bande et exposez la résine photosensible à travers un masque qui présente la surface active des électrodes (Figure 1Cd). Immergez les échantillons dans un révélateur sans ions métalliques pendant 4 minutes pour retirer la résine photosensible exposée. Rincez les échantillons à l’eau et séchez-les à l’aide d’un pistolet à air comprimé (figure 1Ce). Graver le PaC avec une gravure ionique réactive pour ouvrir la surface active des électrodes (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Vérifiez au microscope qu’il n’y a pas de PaC résiduel sur la surface active (Figure 1Cf). Retirer la résine photosensible restante avec de l’acétone, rincer avec de l’isopropanol et sécher les échantillons avec un pistolet à air comprimé. Activer la surface des échantillons à l’aide d’un traitement plasma à l’oxygène pendant 90 s (100 W, 50 sccm). Mélanger une dispersion commerciale de PEDOT:PSS chimiquement polymérisé avec 5 % en volume d’éthylène glycol (EG) et 0,1 % en volume d’acide dodécylbenzène sulfonique (DBSA). Sonifier pendant 15 min. Ajouter 1 % en poids de (3-glycydyloxypropyl)triméthylsiloxane (GOPS) et soniquer pendant 5 min. Filtrer la solution à travers un filtre de 1,2 μm.ATTENTION : L’EG est irritant et présente un danger pour la santé. DBSA est irritant et corrosif. GOPS est corrosif. Portez l’EPI approprié et manipulez ces produits chimiques sous une hotte.REMARQUE : Le volume total dépend du nombre d’échantillons. Pour 10 lames de verre standard, préparez au moins 20 mL qui correspondraient aux quantités suivantes : 18,78 mL de PEDOT:PSS, 1 mL d’EG, 20 μL de DBSA et 200 μL de GOPS. Enduit de spin-coat quatre couches de solution PEDOT:PSS à 150 x g pendant 35 s. Après dépôt de chaque couche, cuire les échantillons à 110 °C pendant 60 s sur une plaque chauffante et les refroidir à température ambiante pendant 5 min avant de faire tourner la couche suivante (figure 1Cg). Retirez la couche de PaC sacrificielle en immergeant les échantillons dans l’eau (Figure 1Ch). Cuire les échantillons à 140 °C pendant 1 h. Plonger les échantillons dans de l’eau désionisée pendant 30 minutes pour éliminer le savon restant et les composés de faible poids moléculaire dans le film PEDOT:PSS et détacher les échantillons du substrat de verre (Figure 1Ci). Raccords et emballage (Figure 1D)Déposer une fine couche de peinture acrylique sur un film de polyimide recouvert de cuivre (figure 1Da). Utiliser un aérosol pour obtenir une couche homogène de peinture (figure 1Db). Modeler la peinture acrylique avec un laser (75 kHz, 7 W, 1 passe laser, 400 mm·s-1) pour obtenir deux tampons de contact rectangulaires (5 mm x 15 mm; espace de 1,5 mm) (Figure 1Dc). Graver le cuivre avec du chlorure ferrique saturé à 30 % (p/v) (FeCl3) dans de l’eau pendant 15 min à 40 °C (figure 1Dd).ATTENTION : Le FeCl3 est irritant et corrosif; Manipulez-le avec des gants sous une hotte. Décaper la peinture acrylique avec de l’acétone en la frottant légèrement avec un chiffon (Figure 1De). Découpez le film de polyimide à motifs en formes rectangulaires (15 mm x 30 mm) à l’aide d’un laser (15 kHz, 10 W, 30 passes laser, 130 mm·s-1) (Figure 1Df). Distribuer la pâte d’argent avec une machine de distribution à trois axes à une pression de trois bars avec une aiguille de 330 μm de diamètre (5 m·min-1) (figure 1Dg).ATTENTION : La pâte d’argent est un irritant; manipuler avec des gants. Aligner et fixer la sonde PaC avec le film polyimide au microscope binoculaire à l’aide d’une pince à épiler (Figure 1Dh).REMARQUE : Les marques d’alignement peuvent être rectifiées à l’étape 1.5.2 pour faciliter le positionnement de la sonde sur les plaquettes de contact. Cuire au four à 140 °C pendant 2 h. Placez un ruban de protection en polyimide de 1 cm2 sur les plaquettes de contact (figure 1Di). Plongez l’interface où la sonde PaC et le film polyimide sont connectés dans PDMS (Figure 1Dj). Cuire au four pendant 2 h à 50 °C. Retirez le ruban de protection pour ouvrir les plaquettes de contact (Figure 1Dk).REMARQUE : La microfabrication des instruments in vitro est similaire, mais les étapes 1.2.1, 1.3 et 1.5 doivent être ignorées. 2. Génération de la lignée cellulaire stable Glioblastoma GCaMP6f Production de lentivirusDans une fiole de 75 cm², cultiver une lignée cellulaire dérivée de HEK 293T optimisée pour la production de lentivirus dans 10 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g· L-1 de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium et complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) sans tétracycline, 100 unités·mL-1 de pénicilline et 100 μg·mL-1 de streptomycine pendant au moins 3 jours jusqu’à 80% de confluence. Retirer le milieu de la fiole. Rincer doucement les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA à 0,25 % et incuber la fiole pendant 5 min à 37 °C.ATTENTION : La solution trypsine/EDTA présente un danger pour la santé; porter l’EPI et manipuler sous une hotte. Ajouter 8 ml de milieu de culture. Rincer doucement la suspension cellulaire. Compter les cellules et plaquer 4 x 106 cellules dans une boîte de Petri dans 8 ml de milieu de culture. Le lendemain, diluer 25 μg du plasmide contenant le gène GCaMP6f et un marqueur de sélection conférant une résistance à la puromycine dans un volume total de 600 μL d’eau. Ajoutez-le à un tube de réactif de transfection. Vortex pendant 10 s à 3 000 tr/min et incuber le tube à température ambiante pendant 10 min pour permettre la production de nanoparticules. Ajouter le contenu du tube goutte à goutte sur la culture de cellules T HEK 293 et balancer doucement à la main. Incuber les cellules à 37 °C pendant au moins 4 h. Remplacez les milieux contenant des complexes de nanoparticules par des milieux frais et remettez les cellules à 37 °C. Trois jours plus tard, recueillir le surnageant et centrifuger à 500 x g pendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Recueillir la phase liquide contenant les particules virales.NOTE: La production de virus dans le surnageant peut être confirmée à l’aide d’un test quantitatif de titre lentiviral et peut être conservée à -80 °C pendant au moins 2 ans. Transduction des cellules du glioblastomeDans une fiole de 75 cm², cultiver des cellules de glioblastome dans 10 mL de DMEM contenant 1 g· L-1 de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium et complété par 10% de FBS sans tétracycline, 100 unités · mL-1 de pénicilline et 100 μg · mL-1 de streptomycine pendant au moins 4 jours. Jeter le milieu et ajouter le surnageant obtenu à l’étape 2.1.9 sur les cellules cibles. Ajouter 5 μg·mL-1 de bromure d’hexadiméthrine dans le milieu pour améliorer la transduction. Incuber pendant 6 h à 37 °C. Remplacer le milieu par 10 ml de milieu frais.ATTENTION : Le bromure d’hexadiméthrine est un irritant. Manipulez-le avec des gants. Génération d’une lignée cellulaire stableDeux à trois jours après la transduction, ajouter 10 mL de DMEM contenant 1 g· L-1 de glucose, L-glutamine, pyruvate de sodium et bicarbonate de sodium, 10% FBS, 100 unités ·mL-1 de pénicilline, 100 μg·mL-1 de streptomycine et complété par de la puromycine pour tuer les cellules non transduites. Cellules de culture dans ce milieu pendant au moins 3 jours.ATTENTION : La puromycine est un irritant; Manipulez-le avec des gants.NOTE: La sensibilité des cellules à la puromycine doit être testée avant la transduction en cultivant des cellules dans leur milieu recommandé contenant différentes concentrations de puromycine. Un jour plus tard, vérifiez les cellules avec un microscope. Choisissez la concentration adéquate à laquelle la majorité des cellules sont mortes mais peu sont encore vivantes, pour s’assurer que l’antibiotique n’est pas trop toxique et pourrait également tuer les cellules transfectées. Retirer le milieu et rincer les cellules avec 10 ml de PBS. Ajouter 1 mL de 0,25 % d’une solution de trypsine/EDTA et incuber la fiole pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 8 ml de milieu de culture. Rincer doucement la suspension cellulaire. Recueillir 100 μL de suspension cellulaire et mesurer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules. Aspirer 50 μL de suspension cellulaire dans un compteur de cellules automatisé portatif avec un capteur de 60 μm. Ensemencer 1 cellule/puits dans une assiette de 96 puits. Par exemple, pour une concentration de 1 x 10 3 cellules par mL, ajouter 1/(1 x 103), soit 0,001 mL de suspension cellulaire par puits. Semer chaque puits pour augmenter les chances de succès. Complet avec milieu de culture pour atteindre un volume total de 200 μL par puits. Un jour plus tard, trouvez chaque puits contenant une cellule et vérifiez sa fluorescence (λexc = 490 nm et λem = 530 nm). Marquez les puits contenant une seule cellule transfectée. Continuez la croissance pendant quelques jours jusqu’à ce que le puits soit presque confluent. Jeter le milieu et rincer les cellules avec 200 μL de PBS. Ajouter 100 μL de solution de trypsine/EDTA à 0,25 % et incuber la plaque à 96 puits pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 100 μL de milieu et rincer doucement la suspension cellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri. Ajouter 5 mL de milieu et laisser les cellules se développer pendant quelques jours jusqu’à ce que la boîte de Petri soit presque confluente. Jeter le milieu et rincer les cellules avec 5 ml de PBS. Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA à 0,25 % et incuber la boîte de Petri pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 6 mL de milieu et rincer doucement la suspension cellulaire. Transvaser la suspension cellulaire dans une fiole T25. Poursuivre la croissance pendant quelques jours jusqu’à ce que la fiole soit presque confluente. Jeter le milieu et rincer les cellules avec 5 ml de PBS. Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA à 0,25 % et incuber la fiole T25 pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 7 mL de DMEM contenant 1 g· L-1 de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, et complété par 10% FBS, 100 unités·mL-1 de pénicilline et 100 μg·mL-1 de streptomycine. Rincer doucement la suspension cellulaire. Diviser la suspension cellulaire en quatre fioles T25 (2 mL par fiole) et ajouter 5 mL de milieu dans chaque fiole. Laissez les cellules se développer pendant quelques jours jusqu’à ce que les flacons soient presque confluents. Répéter l’étape 2.3.12 pour trois flacons et conserver la dernière fiole pour l’étape 3.1.3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 150 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 900 μL. Mélanger délicatement les cellules pour maintenir une suspension cellulaire homogène. Transférer la suspension cellulaire dans des flacons de stockage cryogéniques. Ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde. Placer les cryoflacons à -80 °C pendant la nuit. Transférer les cellules congelées à l’azote liquide pour d’autres expériences.NOTE: L’efficacité de la transfection peut être évaluée en ajoutant 5 μM de sel de calcium ionomycine dans le milieu et en vérifiant l’augmentation induite de la fluorescence au microscope à fluorescence (λexc = 490 nm et λem = 530 nm). 3.3D modèles Culture sphéroïdePréparer une solution d’agarose à 1 % (p/v) dans de l’eau désionisée (DI).Ajouter 100 g de poudre d’agarose dans 100 mL d’eau DI et chauffer la solution dans un four à micro-ondes jusqu’à ce que toute la poudre soit dissoute. Remuez la solution régulièrement pour éviter les grumeaux. Autoclaver la solution pendant 20 min à 120 °C. Une fois récupéré de l’autoclave, ajouter soigneusement 75 μL de solution d’agarose par puits dans une plaque de 96 puits. Déposez-le sur le côté du puits pour former un ménisque, ce qui donne un fond rond non adhérent. Laisser solidifier pendant 15 min à température ambiante. Détacher les cellules (étape 2.3.12) de la fiole obtenue à l’étape 2.3.14. Ajouter 10 000 cellules par puits de cellules de glioblastome et compléter pour atteindre un volume total de 150 μL par puits avec DMEM contenant 1 g· L-1 de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, et complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités·mL-1 de pénicilline et 100 μg·mL-1 de streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C sans bouger la plaque pendant 3 jours. Ensuite, remplacez la moitié du média par un média frais tous les 2 jours avec une pipette multicanal jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées. Gardez l’embout de la pipette dans la partie supérieure du puits pour éviter d’endommager l’agarose ou le sphéroïde lui-même.NOTE: La taille des sphéroïdes dépend du nombre de cellules ensemencées et de la lignée cellulaire, elle doit donc être adaptée en fonction des expériences. Le modèle in ovo Placez les œufs fécondés de caille japonaise (C. japonica) dans un incubateur (37 °C et 57% d’humidité) sur des plateaux munis d’un rotateur automatique qui retourne les œufs toutes les 2 h. Ce jour est considéré comme le jour embryonnaire (ED) 0. Lavez les bateaux de pesage en plastique en les plaçant dans de l’éthanol à 70 % (p/v). Sortez les bateaux de pesage et séchez-les sous une hotte.REMARQUE: À partir de ce point, les expériences ne sont pas effectuées dans des conditions stériles. Cependant, des conditions propres sont nécessaires pour éviter le développement de moisissures sur les embryons. Sur ED3, ouvrir doucement les œufs à l’aide d’une pince à épiler à pointes minces prélavées avec de l’éthanol à 70 % (p/v). Versez l’embryon dans un bateau de pesage en plastique, recouvrez-le d’un autre bateau de pesage et placez-le dans un incubateur humidifié standard à 37 °C pendant 3 jours. Sur ED6, faites une petite incision dans la membrane chorio-allantoïdienne (CAM) avec une aiguille de 23 G. À l’aide d’une pipette, placez un sphéroïde de 7 jours sur l’incision et remettez l’embryon dans l’incubateur pendant 3 jours, jusqu’à d’autres expériences.REMARQUE: Un colorant fluorescent peut être injecté dans l’œil de l’embryon pour visualiser les vaisseaux sanguins. Le jour de l’expérience, placez la sonde flexible sur la tumeur vascularisée à l’aide d’un micromanipulateur. Le in vivo modèleNOTE: Cette partie du protocole est adaptée de celle précédemment publiée en référence14. Des souris fluorescentes multicolores adultes AMU-Neuroinflam (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) ont été utilisées; ces souris présentent le marquage d’une sous-population de Thy1+ neurones par expression transgénique de l’ECFP, marquage de LyzM périphérique+ cellules inflammatoires par expression transgénique de l’EGFP et marquage d’un sous-type de microglie exprimant l’EYFP sous le contrôle de Cd11c+. En bref, les animaux sont légèrement sous sédation avec 1,5% d’isoflurane pendant 2 minutes avant tout traitement ou injection. Avant la chirurgie, les animaux sont anesthésiés avec de la kétamine (120 mg / kg; IP) et la xylazine (12 mg/kg; IP). Ensuite, le gel de lidocaïne à 3% est appliqué localement pour soulager toute douleur dans les oreilles associée à la fixation du support stéréotaxique. Ensuite, une solution de bupivacaïne à 0,25% est administrée au site chirurgical pour soulager toute douleur due à la craniotomie. Une fois la souris préparée pour la chirurgie, une craniotomie de 4 mm de diamètre a été réalisée selon la référence14. Avec une aiguille de 26 G, un trou a été fait dans la dure-mère au milieu de la craniotomie et le sphéroïde tumoral a été injecté avec le système d’injection décrit dans la référence14. De plus, comme décrit ici, une électrode flexible a été placée sur le GCamp6 ou le DsRed exprimant le sphéroïde tumoral avant de sceller la craniotomie avec une fenêtre en verre.Placez une goutte de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco afin qu’elle recouvre la craniotomie. Placez l’électrode flexible sur la goutte de DPBS et placez doucement l’arrière de la sonde avec des pastilles de contact sur le dos de la souris (Figure 4B).REMARQUE: Utilisez des gants stériles et une technique « pointe seulement ». Changez les gants si une surface non stérile est en contact. Fournir un support thermique pendant cette procédure. Touchez la goutte DPBS avec un petit morceau de papier pour absorber la DPBS jusqu’à ce que la sonde puisse reposer à plat sur la dure-mère et suivre la courbure du cerveau. Assurez-vous qu’une petite couche de DPBS reste sous les électrodes sans s’échapper du côté de l’électrode. Cela garantit une barrière contre les débordements de colle lors des étapes suivantes.REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation. Placez une petite goutte d’adhésif silicone sur la sonde et recouvrez-la d’un verre à couverture ronde de 5 mm. Poussez le verre de couverture vers le bas jusqu’à ce que le silicone soit réparti uniformément et que la distance entre le verre de couverture et la sonde soit minimale. Poussez le verre de couvercle vers le bas pendant encore 30 s pour que le silicone puisse se solidifier. Pour fixer le verre de couverture, appliquez rapidement de la superglue sur ses côtés et poussez-la vers le bas jusqu’à ce que la colle durcisse pour devenir solide. À l’aide d’un cure-dent, appliquez de la superglue au niveau du cou de la sonde en veillant à ce que la superglue soit aspirée sous le cou pour lui fournir un soutien stable. Couvrez le crâne avec du ciment dentaire pour construire un capuchon chronique. Prenez soin de ne couvrir que les bords du verre de couverture. Soulevez l’arrière de la sonde et appliquez du ciment sous le col de la sonde. Posez la sonde sur le ciment avant qu’elle ne durcisse. Poussez doucement le col de la sonde avec des pinces émoussées afin que sa surface soit au même niveau que celle du verre de couverture et non sur le chemin de l’objectif du microscope pendant l’expérience. Couvrir le haut du col de la sonde avec pas plus de 1,5 mm de couche de ciment dentaire pour obtenir une prise ferme sur la sonde. Construire un puits de ciment présentant une crête de 1,5 mm à une distance de 1 à 2 mm autour du verre de couverture pour créer un bassin pour le fluide d’immersion pour l’imagerie à deux photons (Figure 4C). Une fois le ciment durci, appliquez des analgésiques post-chirurgicaux à la buprénorphine (0,05 mg/kg, 0,1 mL par 10 g de poids corporel par voie sous-cutanée) et maintenez l’animal dans une atmosphère chaude jusqu’à son réveil. Cela inclut la proximité d’une ampoule infrarouge ainsi que l’emballage de l’animal dans une serviette en papier.REMARQUE: Placez un thermomètre au niveau de la souris pour surveiller la température. Caractériser l’impédance dans la gamme 1-10 kHz à l’aide d’un potentiostat. Laissez l’animal se remettre de la chirurgie pendant au moins 10 jours. Administrer des anti-inflammatoires immédiatement après la chirurgie et continuer à surveiller l’état de l’animal pour fournir une analgésie postopératoire appropriée. 4. Livraison et imagerie par champ électrique pulsé (EEP) Placer les échantillons sous un microscope à fluorescence. Dans le cas des modèles 3D, les tumeurs ne peuvent être observées que par le haut.REMARQUE : Pour le modèle in ovo, les expériences ont été réalisées au microscope à épifluorescence (mais c’est également possible avec un microscope à deux photons), tandis que les expériences sur le modèle in vivo ont été réalisées au microscope à deux photons (figure 6). Connectez un générateur d’impulsions aux tablettes de contact des appareils à l’aide de connecteurs à broche pogo (in vitro) ou de pinces crocodiles (in ovo et in vivo) (Figure 4A). Réglez les paramètres souhaités (nombre d’impulsions, tension, durée des impulsions, fréquence) et appliquez des EEP en faisant fonctionner le générateur (Figure 4A). Mesurez la fluorescence simultanément pour observer les effets des EEP en temps réel.