Dispositivos electrónicos orgánicos flexibles para la terapia de campo eléctrico pulsado del glioblastoma

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y de conformidad con la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La investigación en animales fue autorizada por la Dirección Departamental de Servicios Vétérinaires des Bouches-du-Rhône y aprobada por el comité ético de Provenza Costa Azul (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Microfabricación de dispositivos flexibles (Figura 1) Limpieza de los portaobjetos de vidrioEl vidrio sónico se desliza en solución jabonosa al 2% durante 15 min. Enjuáguelos con agua. Sonicar de nuevo en una mezcla de 80% de acetona pura y 20% de isopropanol puro durante 15 min.PRECAUCIÓN: Estos disolventes son nocivos e inflamables. Use equipo de protección personal (EPP) y manéjelo debajo de una campana extractora. Enjuague las diapositivas con isopropanol y séquelas con una pistola de aire comprimido.NOTA: Asegúrese de que la acetona no se seque sobre los sustratos durante todo el proceso. Patrones de electrodos de oro (Figura 1A)Depositar una capa de 3 μm de parileno-C (PaC) con un sistema de deposición de parileno (Figura 1Aa).Coloque los portaobjetos de vidrio limpios en la cámara de deposición. Rocíe jabón en el enfriador, déjelo secar e insértelo en la trampa fría designada del sistema de deposición. Este antiadhesivo facilita la fácil eliminación de PaC del enfriador después de la deposición.PRECAUCIÓN: La PaC es un irritante y representa un peligro para la salud. Use guantes mientras lo manipula. Pesar 6 g de PaC en un bote de aluminio y colocarlo en el horno. Evacue la máquina (P = 10 mTorr) e inicie la deposición con los siguientes parámetros:Enfriador T = -100 °C,Horno T = 690 °C,Vaporizador T = 175 °C yCámara T = 135 °C. Cuando termine la deposición y la temperatura del vaporizador esté por debajo de 40 °C, apague el enfriador, el vaporizador y el horno. Ventile la máquina y recoja las muestras. Activar la superficie de las muestras mediante tratamiento con plasma oxigenado durante 30 s (100 W, 50 sccm). Centrifugar las muestras tratadas con plasma con una fotorresistencia negativa a 1.000 x g durante 40 s. Colocar las muestras en una placa caliente a 110 °C durante 2 min (Figura 1Ab).PRECAUCIÓN: La solución fotorresistente es inflamable y causa irritación; Use EPP y manéjelo debajo de una campana extractora. Coloque un filtro i-line en la línea de luz del alineador de contacto de banda ancha UV y exponga la fotorresistencia a través de una máscara que presenta el diseño de electrodo interdigitado (Figura 1Ac).NOTA: Los electrodos interdigitados con un espacio de 50 o 250 μm se diseñaron utilizando un editor de diseño y las fotomáscaras se encargaron a una empresa que produce fotomáscaras de poliéster mediante fototrazado láser. Hornea las muestras anteriores a 110 °C en una placa caliente durante 3 minutos y déjalas enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Sumerja las muestras en un revelador sin iones metálicos durante 3 minutos para eliminar la fotorresistencia no expuesta. Enjuague las muestras con agua y séquelas con una pistola de aire comprimido (Figura 1Ad).PRECAUCIÓN: La solución para desarrolladores es irritante; use EPP y mango debajo de una campana extractora. Activar la superficie de las muestras mediante tratamiento con plasma oxigenado durante 60 s (100 W, 50 sccm). Deposite una capa de adhesión de 20 nm de cromo y una capa de oro de 300 nm con un evaporador térmico de la siguiente manera (Figura 1Ae). Ventile la máquina evaporadora y recorte las muestras (boca abajo) en la placa redonda superior con tornillos metálicos. Llena los crisoles dedicados, respectivamente, con cromo y oro. Selle y evacúe la máquina para alcanzar una presión inferior a 5,10-6 Torr. Inicie la rotación del portamuestras. Seleccione el crisol que contiene cromo y aumente lentamente la corriente que lo atraviesa hasta alcanzar una tasa de deposición de 0,2 Å·s-1 . Abra el obturador y espere hasta que se depositen 20 nm de cromo. Cierre el obturador y reduzca lentamente la corriente hasta 0 mA. Seleccione el crisol que contiene oro y aumente lentamente la corriente que lo atraviesa hasta alcanzar una tasa de deposición de 0,2 Å·s-1 . Abra el obturador para evaporar oro, espere hasta que se depositen 10 nm de oro y luego aumente la tasa de deposición a 1.5 Å·s-1 hasta que se depositen aproximadamente 300 nm. Cierre el obturador y reduzca lentamente la corriente a 0 mA. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 15 minutos después de la deposición. Detenga la rotación del portamuestras, ventile la máquina y recoja las muestras. Sumerja las muestras en un vaso de precipitados con acetona. Coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación ajustada a 110 rpm durante 15 minutos para levantar la fotorresistencia. Enjuague las muestras con isopropanol y séquelas con una pistola de aire comprimido (Figura 1Af). Activar la superficie de las muestras mediante tratamiento con plasma oxigenado durante 30 s (100 W, 50 sccm). Depositar una capa de aislamiento de 3 μm de PaC con un sistema de deposición de parileno (véase el paso 1.2.1) (Figura 1Ag). Apertura del contorno (Figura 1B)Centrifugar las muestras con una fotorresistencia positiva a 600 x g durante 35 s. Colóquelo en una placa caliente a 110 °C durante 2 min (Figura 1Ba).PRECAUCIÓN: La solución fotorresistente es inflamable y causa irritación; use EPP y mango debajo de una campana extractora. Asegúrese de que no haya ningún filtro i-line en la línea de luz del alineador de contacto de banda ancha UV y exponga la fotorresistencia a través de una máscara que muestre el contorno del dispositivo con un alineador de contacto de banda ancha UV (Figura 1Bb). Sumerja las muestras en un revelador sin iones metálicos durante 4 minutos para eliminar la fotorresistencia expuesta. Enjuague las muestras con agua y séquelas con una pistola de aire comprimido (Figura 1Bc). Grabar el contorno a través de las dos capas de PaC con un grabador iónico reactivo (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figura 1Bd). Retire la fotorresistencia restante con acetona, enjuague con isopropanol y seque las muestras con una pistola de aire comprimido. PEDOT:Recubrimiento PSS (Figura 1C)Estérese una solución de jabón al 2% a 70 x g durante 35 s (Figura 1Ca). Depositar una capa de sacrificio de 3 μm de PaC con un sistema de deposición de parileno (véase el paso 1.2.1) (Figura 1Cb). Fotorresistencia positiva spin-coat a 600 x g durante 35 s. Colocar las muestras en una placa caliente a 110 °C durante 2 min (Figura 1Cc). Asegúrese de que no haya ningún filtro i-line en la línea de luz del alineador de contacto de banda ancha UV y exponga la fotorresistencia a través de una máscara que muestre la superficie activa de los electrodos (Figura 1Cd). Sumerja las muestras en un revelador sin iones metálicos durante 4 minutos para eliminar la fotorresistencia expuesta. Enjuague las muestras con agua y séquelas con una pistola de aire comprimido (Figura 1Ce). Grabar el PaC con un grabador iónico reactivo para abrir la superficie activa de los electrodos (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Verifique con un microscopio que no haya PaC residual en la superficie activa (Figura 1Cf). Retire la fotorresistencia restante con acetona, enjuague con isopropanol y seque las muestras con una pistola de aire comprimido. Activar la superficie de las muestras mediante tratamiento con plasma oxigenado durante 90 s (100 W, 50 sccm). Mezcle una dispersión comercial de PEDOT:PSS químicamente polimerizado con 5 vol% de etilenglicol (EG) y 0.1 % en volumen de ácido dodecilbenceno sulfónico (DBSA). Sonicate durante 15 min. Agregue 1% en peso de (3-gliciloxipropil) trimetilsiloxano (GOPS) y sonicate durante 5 min. Filtrar la solución a través de un filtro de 1,2 μm.PRECAUCIÓN: EG es un irritante y representa un peligro para la salud. DBSA es un irritante y corrosivo. GOPS es corrosivo. Use el EPP adecuado y manipule estos productos químicos debajo de una campana extractora.NOTA: El volumen total depende del número de muestras. Para 10 portaobjetos de vidrio estándar, prepare al menos 20 ml que correspondan a las siguientes cantidades: 18,78 ml de PEDOT:PSS, 1 ml de EG, 20 μL de DBSA y 200 μL de GOPS. Estirar cuatro capas de solución PEDOT:PSS a 150 x g durante 35 s. Después de la deposición de cada capa, hornear las muestras a 110 °C durante 60 s en una placa caliente y enfriarlas a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de girar la siguiente capa (Figura 1Cg). Retire la capa de PaC sacrificial sumergiendo las muestras en agua (Figura 1Ch). Hornear las muestras a 140 °C durante 1 h. Sumerja las muestras en agua desionizada durante 30 minutos para eliminar el jabón restante y los compuestos de bajo peso molecular en la película PEDOT:PSS y para separar las muestras del sustrato de vidrio (Figura 1Ci). Conexiones y embalaje (Figura 1D)Deposite una capa delgada de pintura acrílica sobre una película de poliimida que esté recubierta con cobre (Figura 1Da). Utilice un aerosol para obtener una capa homogénea de pintura (Figura 1Db). Modelar la pintura acrílica con un láser (75 kHz, 7 W, 1 paso láser, 400 mm·s-1) para obtener dos almohadillas de contacto rectangulares (5 mm x 15 mm; espacio de 1,5 mm) (Figura 1Dc). Grabado húmedo del cobre con cloruro férrico saturado al 30% (p/v) (FeCl3) en agua durante 15 min a 40 °C (Figura 1Dd).PRECAUCIÓN: FeCl3 es un irritante y corrosivo; Manéjelo con guantes debajo de una campana extractora. Pelar la pintura acrílica con acetona frotándola ligeramente con un paño (Figura 1De). Corte la película de poliimida estampada en formas rectangulares (15 mm x 30 mm) con un láser (15 kHz, 10 W, 30 pasadas láser, 130 mm·s-1) (Figura 1Df). Dispensar pasta de plata con una máquina dispensadora de tres ejes a una presión de tres bar con una aguja de 330 μm de diámetro (5 m·min-1) (Figura 1Dg).PRECAUCIÓN: La pasta de plata es un irritante; mango con guantes. Alinee y fije la sonda PaC con la película de poliimida bajo un microscopio binocular utilizando pinzas (Figura 1Dh).NOTA: Las marcas de alineación se pueden modelar en el paso 1.5.2 para facilitar el posicionamiento de la sonda en las almohadillas de contacto. Hornear a 140 °C durante 2 h en el horno. Coloque una cinta de protección de poliimida de 1 cm2 en las almohadillas de contacto (Figura 1Di). Sumerja la interfaz donde la sonda PaC y la película de poliimida están conectadas en PDMS (Figura 1Dj). Hornear durante 2 h a 50 °C. Retire la cinta de protección para abrir las almohadillas de contacto (Figura 1Dk).NOTA: La microfabricación de dispositivos in vitro es similar, pero se deben omitir los pasos 1.2.1, 1.3 y 1.5. 2. Generación de línea celular estable GCaMP6f de glioblastoma Producción de lentivirusEn un matraz de 75 cm², cultivar una línea celular derivada de HEK 293T optimizada para la producción de lentivirus en 10 ml de medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco que contenga 4,5 g· L-1 de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio y suplementado con suero fetal bovino (FBS) libre de tetraciclina al 10%, 100 unidades·mL-1 de penicilina y 100 μg·mL-1 de estreptomicina durante al menos 3 días hasta la confluencia del 80%. Retirar el medio del matraz. Enjuague suavemente las células con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 1 ml de solución de tripsina/EDTA al 0,25% e incubar el matraz durante 5 min a 37 °C.PRECAUCIÓN: La solución de tripsina/EDTA representa un peligro para la salud; use EPP y mango debajo de una campana extractora. Añadir 8 mL de medio de cultivo. Enjuague suavemente la suspensión celular. Contar las células y la placa 4 x 106 células en una placa de Petri en 8 ml de medio de cultivo. Al día siguiente, diluir 25 μg del plásmido que contiene el gen GCaMP6f y un marcador de selección que confiere resistencia a la puromicina en un volumen total de 600 μL de agua. Agréguelo a un tubo de reactivo de transfección. Vortex durante 10 s a 3.000 rpm e incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 min para permitir la producción de nanopartículas. Agregue el contenido del tubo gota a gota sobre el cultivo de células T HEK 293 y moleste suavemente a mano. Incubar las células a 37 °C durante al menos 4 h. Reemplace los medios que contienen complejos de nanopartículas con medios nuevos y devuelva las células a 37 ° C. Tres días después, recoja el sobrenadante y centrifugar a 500 x g durante 10 minutos para eliminar los desechos celulares. Recoja la fase líquida que contiene partículas virales.NOTA: La producción del virus en el sobrenadante puede confirmarse mediante una prueba cuantitativa de títulos lentivirales y puede almacenarse a -80 °C durante al menos 2 años. Transducción de células de glioblastomaEn un matraz de 75 cm², cultivar células de glioblastoma en 10 ml de DMEM que contengan 1 g· L-1 de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio y suplementado con FBS libre de tetraciclina al 10%, 100 unidades·mL-1 de penicilina y 100 μg·mL-1 de estreptomicina durante al menos 4 días. Desechar el medio y añadir el sobrenadante obtenido en el paso 2.1.9 en las células diana. Añadir 5 μg·mL-1 de bromuro de hexadimetrina en el medio para mejorar la transducción. Incubar durante 6 h a 37 °C. Reemplace el medio con 10 ml de medio fresco.PRECAUCIÓN: El bromuro de hexadimetrina es un irritante. Manéjelo con guantes. Generación de una línea celular estableDos o tres días después de la transducción, añadir 10 ml de DMEM que contenga 1 g· L-1 de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, 10% FBS, 100 unidades·mL-1 de penicilina, 100 μg·mL-1 de estreptomicina y suplementado con puromicina para matar las células no transducidas. Cultivo de células en este medio durante al menos 3 días.PRECAUCIÓN: La puromicina es un irritante; Manéjelo con guantes.NOTA: La sensibilidad de las células a la puromicina debe probarse antes de la transducción mediante el cultivo de células en su medio recomendado que contienen diferentes concentraciones de puromicina. Un día después, revise las células con un microscopio. Elija la concentración adecuada en la que la mayoría de las células están muertas pero pocas siguen vivas, para asegurarse de que el antibiótico no sea demasiado tóxico y pueda matar también las células transfectadas. Retire el medio y enjuague las células con 10 ml de PBS. Añadir 1 ml de solución de tripsina/EDTA al 0,25% e incubar el matraz durante 5 min a 37 °C. Añadir 8 mL de medio de cultivo. Enjuague suavemente la suspensión celular. Recoja 100 μL de suspensión celular y mida la concentración celular con un contador celular. Aspire 50 μL de suspensión celular en un contador de celdas automatizado de mano con un sensor de 60 μm. Semilla 1 célula/pocillo en una placa de 96 pocillos. Por ejemplo, para una concentración de 1 x 10 3 células por ml, agregue 1 / (1 x 103), es decir, 0.001 ml de suspensión celular por pocillo. Siembra cada pozo para aumentar las posibilidades de éxito. Completar con medio de cultivo para alcanzar un volumen total de 200 μL por pocillo. Un día después, encuentre cada pocillo que contenga una celda y verifique su fluorescencia (λexc = 490 nm y λem = 530 nm). Marque los pocillos que contienen una sola celda transfectada. Continúe el crecimiento durante unos días hasta que el pozo sea casi confluente. Deseche el medio y enjuague las células con 200 μL de PBS. Añadir 100 μL de solución de tripsina/EDTA al 0,25% e incubar la placa de 96 pocillos durante 5 min a 37 °C. Añadir 100 μL de medio y enjuagar suavemente la suspensión celular. Transfiera la suspensión celular en una placa de Petri. Agregue 5 ml de medio y deje que las células crezcan durante unos días hasta que la placa de Petri sea casi confluente. Deseche el medio y enjuague las células con 5 ml de PBS. Añadir 1 ml de solución de tripsina/EDTA al 0,25% e incubar la placa de Petri durante 5 min a 37 °C. Agregue 6 ml de medio y enjuague suavemente la suspensión celular. Transfiera la suspensión celular a un matraz T25. Continuar el crecimiento durante unos días hasta que el matraz sea casi confluente. Deseche el medio y enjuague las células con 5 ml de PBS. Añadir 1 ml de solución de tripsina/EDTA al 0,25% e incubar el matraz T25 durante 5 min a 37 °C. Añadir 7 ml de DMEM que contenga 1 g· L-1 de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, y suplementado con 10% de FBS, 100 unidades·mL-1 de penicilina y 100 μg·mL-1 de estreptomicina. Enjuague suavemente la suspensión celular. Dividir la suspensión celular en cuatro matraces T25 (2 ml por matraz) y añadir 5 ml de medio a cada matraz. Deje que las células crezcan durante unos días hasta que los matraces sean casi confluentes. Repita el paso 2.3.12 para tres matraces y conserve el último matraz para el paso 3.1.3. Transfiera la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 150 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 900 μL. Mezcle suavemente las células para mantener una suspensión celular homogénea. Transfiera la suspensión celular a viales de almacenamiento criogénico. Añadir 100 μL de dimetilsulfóxido. Colocar los crioviales a -80 °C durante la noche. Transfiera células congeladas a nitrógeno líquido para otros experimentos.NOTA: La eficiencia de la transfección puede evaluarse añadiendo 5 μM de sal de ionomicina cálcica en el medio y comprobando el aumento inducido de fluorescencia bajo un microscopio de fluorescencia (λexc = 490 nm y λem = 530 nm). 3.3D modelos Cultivo de esferoidesPrepare una solución de agarosa al 1% (p/v) en agua desionizada (DI).Añadir 100 g de agarosa en polvo en 100 ml de agua DI y calentar la solución en un horno de microondas hasta que todo el polvo se disuelva. Revuelva la solución regularmente para evitar grumos. Autoclave la solución durante 20 min a 120 °C. Una vez recuperado del autoclave, agregue 75 μL de solución de agarosa por pocillo en una placa de 96 pocillos cuidadosamente. Deposítelo en el lado del pozo para formar un menisco, lo que resulta en un fondo redondo no adherente. Deje que se solidifique durante 15 minutos a temperatura ambiente. Separar las células (paso 2.3.12) del matraz obtenido en el paso 2.3.14. Añadir 10.000 células por pocillo de células de glioblastoma y completar hasta alcanzar un volumen total de 150 μL por pocillo con DMEM que contiene 1 g· L-1 de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, y suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades·mL-1 de penicilina y 100 μg·mL-1 de estreptomicina. Incubar las células a 37 °C sin mover la placa durante 3 días. Luego, reemplace la mitad de los medios con medios nuevos cada 2 días con una pipeta multicanal hasta que se realicen más experimentos. Mantenga la punta de la pipeta en la parte superior del pocillo para evitar daños en la agarosa o en el propio esferoide.NOTA: El tamaño de los esferoides depende del número de células sembradas y de la línea celular, por lo que debe adaptarse en función de los experimentos. El modelo in ovo Coloque los huevos fertilizados de codorniz japonesa (C. japonica) en una incubadora (37 °C y 57% de humedad) en bandejas con un rotador automático que gira los huevos cada 2 h. Este día se considera Día del Embrión (DE) 0. Lave los botes de pesaje de plástico colocándolos en etanol al 70% (p/v). Saque los botes de pesaje y séquelos bajo una campana extractora.NOTA: A partir de este punto, los experimentos no se realizan en condiciones estériles. Sin embargo, se requieren condiciones limpias para evitar el desarrollo de moho en los embriones. En ED3, abra suavemente los huevos con una pinza con puntas delgadas prelavadas con etanol al 70% (p/v). Vierta el embrión en un bote de pesaje de plástico, cúbralo con otro bote de pesaje y colóquelo en una incubadora humidificada estándar a 37 °C durante 3 días. En ED6, hacer una pequeña incisión en la membrana corioalantoidea (CAM) con una aguja de 23 G. Usando una pipeta, coloque un esferoide de 7 días en la incisión y devuelva el embrión a la incubadora durante 3 días, hasta que se realicen más experimentos.NOTA: Se puede inyectar un tinte fluorescente en el ojo del embrión para visualizar los vasos sanguíneos. El día del experimento, coloque la sonda flexible sobre el tumor vascularizado usando un micromanipulador. El in vivo modeloNOTA: Esta parte del protocolo está adaptada de la publicada anteriormente en referencia14. Se utilizaron ratones adultos fluorescentes multicolor AMU-Neuroinflam (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); estos ratones presentan etiquetado de una subpoblación de Thy1+ neuronas por expresión transgénica de ECFP, marcaje de LyzM periférico+ células inflamatorias por expresión transgénica de EGFP y etiquetado de un subtipo de microglía que expresa EYFP bajo el control de Cd11c+. En resumen, los animales son ligeramente sedados con isoflurano al 1,5% durante 2 minutos antes de cualquier tratamiento o inyección. Antes de la cirugía, los animales son anestesiados con ketamina (120 mg/kg; IP) y xilazina (12 mg/kg; IP). Luego, el gel de lidocaína al 3% se aplica localmente para aliviar cualquier dolor en los oídos asociado con la fijación del soporte estereotáctico. Luego, se administra una solución de bupivacaína al 0,25% en el sitio quirúrgico para aliviar cualquier dolor debido a la craneotomía. Una vez preparado el ratón para la cirugía, se realizó una craneotomía de 4 mm de diámetro según referencia14. Con una aguja de 26 G, se hizo un orificio en la duramadre en el medio de la craneotomía y se inyectó el esferoide tumoral con el sistema de inyección descrito en la referencia14. Además, como se describe aquí, se colocó un electrodo flexible en el esferoide tumoral GCamp6 o DsRed antes de sellar la craneotomía con una ventana de vidrio.Coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para que cubra la craneotomía. Coloque el electrodo flexible en la gota de DPBS y coloque suavemente la parte posterior de la sonda con almohadillas de contacto en la parte posterior del ratón (Figura 4B).NOTA: Use guantes estériles y una técnica de “solo punta”. Cambie los guantes si entra en contacto con una superficie no estéril. Proporcione soporte térmico durante este procedimiento. Toque la gota de DPBS con un pequeño trozo de papel para absorber DPBS hasta que la sonda pueda colocarse plana sobre la duramadre y seguir la curvatura del cerebro. Asegúrese de que una pequeña capa de DPBS permanezca debajo de los electrodos sin escapar del lado del electrodo. Esto asegura una barrera contra el derrame de pegamento durante los siguientes pasos.NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo. Coloque una pequeña gota de adhesivo de silicona sobre la sonda y cúbrala con un vidrio de cubierta redonda de 5 mm. Empuje el vidrio de la cubierta hacia abajo hasta que la silicona se distribuya uniformemente y la distancia entre el vidrio de la cubierta y la sonda sea mínima. Empuje el vidrio de la cubierta hacia abajo durante otros 30 s para que la silicona pueda solidificarse. Para asegurar el vidrio de la cubierta, aplique rápidamente superglue en sus lados y empújelo hacia abajo hasta que el pegamento se cure a sólido. Usando un palillo de dientes, aplique superglue en el cuello de la sonda teniendo cuidado de que el superglue se dibuje debajo del cuello para proporcionarle un soporte estable. Cubra el cráneo con cemento dental para construir una tapa crónica. Tenga especial cuidado de cubrir solo los bordes del vidrio de la cubierta. Levante la parte posterior de la sonda y aplique cemento debajo del cuello de la sonda. Coloque la sonda sobre el cemento antes de que se cure. Empuje suavemente el cuello de la sonda con pinzas romas para que su superficie esté al mismo nivel que la del vidrio de la cubierta y no en el camino del objetivo del microscopio durante el experimento. Cubra la parte superior del cuello de la sonda con no más de 1,5 mm de capa de cemento dental para lograr una sujeción firme de la sonda. Construya un pozo de cemento que presente una cresta de 1,5 mm a una distancia de 1-2 mm alrededor del vidrio de la cubierta para crear un recipiente para el fluido de inmersión para la obtención de imágenes de dos fotones (Figura 4C). Después de que el cemento se haya curado, aplique analgésicos postquirúrgicos de buprenorfina (0,05 mg / kg, 0,1 ml por 10 g de peso corporal por vía subcutánea) y mantenga al animal en un ambiente cálido hasta que se despierte. Esto incluye la proximidad a una bombilla infrarroja, así como envolver al animal en una toalla de papel.NOTA: Coloque un termómetro al nivel del ratón para controlar la temperatura. Caracterizar la impedancia en el rango de 1-10 kHz utilizando un potenciostato. Deje que el animal se recupere de la cirugía durante al menos 10 días. Administrar medicamentos antiinflamatorios inmediatamente después de la cirugía y continuar monitoreando el estado del animal para proporcionar una analgesia postoperatoria adecuada. 4. Suministro de campo eléctrico pulsado (PEF) e imágenes Coloque las muestras bajo un microscopio de fluorescencia. En el caso de los modelos 3D, los tumores solo se pueden observar desde la parte superior.NOTA: Para el modelo in ovo , los experimentos se realizaron bajo un microscopio de epifluorescencia (pero también es posible con un microscopio de dos fotones), mientras que los experimentos en el modelo in vivo se realizaron bajo un microscopio de dos fotones (Figura 6). Conecte un generador de impulsos a las almohadillas de contacto de los dispositivos, utilizando conectores de pin pogo (in vitro) o pinzas de cocodrilo (in ovo e in vivo) (Figura 4A). Establezca los parámetros deseados (número de pulsos, voltaje, duración del pulso, frecuencia) y aplique PEF haciendo funcionar el generador (Figura 4A). Mida la fluorescencia simultáneamente para observar los efectos de los PEF en tiempo real.