Um método de injeção intradutal de reagentes para uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária do camundongo para a imagem in vivo e prevenção do câncer de mama é descrito. A injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos colaterais mínimos.
O câncer de mama é o câncer mais prevalente e a segunda causa de morte relacionada ao câncer para mulheres nos EUA. Para mulheres de alto risco, a mastectomia profilática é a estratégia de prevenção primária mais eficaz. A mastectomia profilática é um procedimento cirúrgico agressivo que remove completamente as células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge junto com o tecido circundante. Buscamos desenvolver um procedimento intradutal minimamente invasivo como alternativa à mastectomia profilática para abolar localmente as células epiteliais mamárias antes que elas possam se tornar malignas. Nós e outros desenvolvemos um procedimento de parto intradutor para alcançar e tratar essas células epiteliais em modelos de roedores de câncer de mama. Enquanto a glândula mamária do rato com uma única abertura de árvore ductal não anastomosa no mamilo tem uma arquitetura muito menos complexa e tortuosa do que a mama humana, modelos de camundongos quimicamente induzidos e geneticamente modificados de câncer de mama são valiosos para produzir estudos de prova de conceito de novas estratégias preventivas. Aqui, descrevemos um procedimento para a entrega intradutal de uma solução ablativa à base de etanol contendo agente de contraste à base de tântalo micro-CT/raios-X dentro da árvore ductal mamária do camundongo para fins terapêuticos de prevenção primária do câncer de mama. A entrega intradutora de reagentes aquosos (por exemplo, compostos citotóxicos, siRNAs, AdCre) foi descrita anteriormente em modelos de camundongos. Assim, focamos nossa descrição protocolar em modificações metodológicas e considerações experimentais únicas para a otimização da entrega de etanol, para minimizar os efeitos colaterais locais e sistêmicos da administração do etanol e para a visualização in vivo do enchimento de árvores ductais via micro-CT/fluoroscopia. A visualização da árvore ductal imediatamente após a injeção de uma solução contendo contraste permite a confirmação de preenchimento completo ou desfechos mal sucedidos, como enchimento ou sobresso. Este procedimento pode ser aplicado para o parto e imagem de outros compostos ablativos destinados a prevenir a formação de tumores ou tratar localmente tumores em estágio inicial acessíveis através da árvore ductal.
O câncer de mama é uma doença comum e potencialmente letal, com poucas opções disponíveis para prevenção1. A intervenção mais eficaz é a mastectomia profilática; no entanto, apenas indivíduos de alto risco optam por se submeter a esse procedimento, pois é uma cirurgia com grandes consequências que mudam a vida2. O procedimento remove completamente as células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge junto com o tecido circundante. Isso pode resultar em estresse físico, psicológico e social para o indivíduo, e muitas vezes dissuade os indivíduos de prosseguir com este procedimento cirúrgico como sua primeira linha de intervenção primária.
Demonstramos que a entrega de uma solução ablativa contendo 70% de etanol (EtOH) diretamente na árvore ductal é eficaz na morte de células epiteliais mamárias com danos colaterais limitados no tecido colateral e na prevenção de tumores mamários em modelos de camundongos3. O ETOH tem sido usado clinicamente por muito tempo como um agente ablativo ou esclero para tratamento local. A injeção de EtOH percutâneo é usada como agente ablativo para tumores hepáticos não ressecáveis, neoplasias renais e adrenais e tumores cisticísticos pancreáticos4,5,6; para neurolise celíaca plexo para reduzir a dor7; e para tratar pseudoaneurysms 8 mama. A injeção de EtOH intravascular é usada como agente esclero para eliminar o inchaço e a deformação das malformações arteriovenosas (AVM) e para tratamento cosmético de veias de aranha e varizes9,10,11,12,13. Como a mastectomia profilática, o sucesso da prevenção com a entrega local de uma solução ablativa depende da capacidade de remover completamente todas as células epiteliais mamárias das quais o câncer poderia potencialmente surgir. Isso requer a confirmação de que a substância ablativa preencheu com sucesso a árvore ductal, entrando em contato diretamente com todas as células epiteliais mamárias. Os meios clínicos para injetar substâncias dentro das glândulas mamárias e visualizá-las por fluoroscopia ou ductografia guiadas por imagem estão prontamente disponíveis14,15; portanto, será possível entregar e confirmar a entrega bem sucedida quando este procedimento pode justificar a avaliação em ensaios clínicos.
Demonstrar a viabilidade dessa abordagem guiada por imagens em animais de laboratório é um passo fundamental para estabelecer a eficácia e a viabilidade translacional da ablação intradutal (ID) como medida preventiva para o câncer de mama. Em nosso laboratório, desenvolvemos um método para injetar com sucesso todas as glândulas mamárias em camundongos com uma solução ablativa contendo um agente de contraste ao longo de um curso de injeções semanais para garantir que o animal não sucumba a uma overdose de EtOH (Figura 1, Figura 2, referência n.3,16). Este procedimento coloca uma agulha de 34 G dentro da abertura do mamilo de um rato isoflurane-anesthetizado para injetar a solução de teste. Algumas melhorias fundamentais do procedimento incluem o uso de seringas gastight para líquidos e gases, injeção de maiores volumes por árvores ductais17 e tratamento anti-inflamatório prolongado. O tratamento pré-clínico de 5 mg/kg de carprofeno, um NSAID, de 2 d antes de 7 d após o procedimento de IDENTIDADE está em consonância com o da terapia clínica de esclerose para AVM. Normalmente, após anestesia sistêmica, os pacientes recebem medicamentos anti-inflamatórios, como NSAIDs, durante 2 dias após o procedimento que podem ser estendidos para mitigar qualquer inflamação local ou dor12. A intoxicação alcoólica é significativamente atenuada pela injeção intraperitoneal de uma solução de sacarose de 5% em camundongos. Com a administração desta solução de sacarose, os camundongos podem ser injetados com segurança com até 160 μL de 70% etoh (até quatro árvores ductais; cerca de 0,4 g/dL de conteúdo EtOH no sangue); animais totalmente recuperados dentro de 4 horas após injeções de ID. Para a injeção de mais de quatro glândulas em camundongos e/ou concentrações etoh mais altas, realizamos sessões sequenciais para permitir tempo suficiente de recuperação. A intoxicação por álcool em mulheres seria uma preocupação menor devido à menor proporção de álcool no peso corporal. Dado o número de árvores ductais em mama humana14,15, cerca de 16, e volume estimado para encher cada duto de árvore18,19, até 32 mL de 70% de EtOH serão administrados. Essa quantidade será muito inferior aos 50 mL de 95% de EtOH administrados em outros procedimentos clínicos4,9. A administração intravenosa da solução de tiamina e glicose poderia ser usada para minimizar ainda mais os efeitos da intoxicação etoh, especialmente nos casos em que um volume total maior de EtOH pode precisar ser injetado e/ou para mulheres que têm uma menor tolerância ao consumo de álcool (por exemplo, variantes allelic em álcool ou desidrogenases aldeídas).
A imagem via micro-CT/fluoroscopia nos permite confirmar o preenchimento ductal bem sucedido de cada glândula (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Isso pode ser registrado para análise futura, ou avaliado no momento através de imagens de fluoroscopia em tempo real, como seria feito na aplicação clínica, para limitar a carga global de radiação imposta ao animal. Para melhorar ainda mais as características específicas desta solução ablativa para entrega guiada por imagem em tempo real in vivo, comparamos anteriormente o contraste contendo iodo aprovado pela FDA a um óxido de tântalo (TaOx) sintetizado pelo laboratório Shapiro3,16. TaOx mostrou desempenho superior como agente de contraste micro-CT para visualizar o preenchimento inicial da árvore ductal (Figura 2, Figura 3). TaOx pode ser usado como um contraste de referência para realizar uma avaliação mais sistemática e longitudinal de outros agentes de contraste da piscina de sangue à base de nanopartículas (por exemplo, iodo-, bismuto-ou contendo ouro) e compatibilidade de TaOx com diferentes concentrações de celulose etil como agente de gelagem20,21.
A mastectomia profilática é atualmente a intervenção mais eficaz para o câncer de mama, mas tem alguns impactos negativos graves. A ablação local de células epiteliais mamárias com uma solução baseada em EtOH é uma terapia alternativa promissora, como demonstramos em um estudo de prova de conceito sobre o agressivo modelo de camundongo fvb-tg-C3(1)-TAg do câncer de mama3. A injeção de ID desta solução ablativa permite o direcionamento das células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge com danos colaterais limitados. A adição de um agente de contraste de raios-X à solução ablativa permite uma compreensão aprimorada da eficácia da solução na prevenção, pois podemos ver se cada árvore ductal é preenchida com sucesso após a injeção (Figura 2B). Visualização de glândulas injetadas por fluoroscopia imediatamente pós-injeção espelha o que provavelmente será feito na clínica para confirmar o preenchimento bem sucedido da árvore ductal. A confirmação visual da entrega da solução informará melhor se todas as partes da árvore foram atingidas em tempo real. Isso poderia permitir que mais injeção fosse realizada para completar o preenchimento no momento ou em uma sessão futura. É de grande importância que a solução ablativa atinja todas as partes da árvore ductal para garantir que todas as células epiteliais possam ser acessadas para matar (Figura 3). Deixar para trás células epiteliais vivas dentro da árvore permitiria a possibilidade de que o câncer de mama ainda pudesse surgir. Utilizar o contraste nas injeções de ID para o sucesso da imagem da injeção também pode ser útil para outras formulações. A Tabela 1 fornece solução de problemas e dicas úteis. Outros estudos descreveram protocolos de entrega de ID para partículas virais (por exemplo, AdCre, guia CRISPR RNAs), hormônios, compostos citotóxicos, siRNAs e/ou agentes de mira em camundongos3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 38, ratos24,32,39,40,41 e coelhos42,43,44,45,46,47. Estudos clínicos independentes relataram cannulação bem sucedida de até oito dutos por mama para parto local de quimioterapia40,48,49. Visualizar o preenchimento completo ao entregar outras soluções voltadas para a prevenção ou voltadas para o tratamento valeria a pena por razões semelhantes. O conhecimento de que a solução atingiu todos os ramos e extremidades terminais da árvore será informativo na avaliação bem sucedida de prevenção ou tratamento.
Não estamos cientes de nenhum outro método de imagem intradutal em camundongos33,34 ou outros modelos animais47 que oferecem a alta resolução de nanopartículas TaOx. Note-se que o TaOx na árvore ductal murina supera os agentes de contraste aprovados pela FDA para a ductografia diagnóstica3,16. À medida que continuamos a avaliar o procedimento ablativo de IDENTIDADE para sua capacidade de prevenir o câncer de mama, poderemos determinar com mais precisão de quais glândulas o câncer surge com a ajuda de dados adicionais fornecidos através de imagens após o parto de 3. Por exemplo, pode-se determinar se uma glândula que foi apenas parcialmente preenchida é mais provável do que uma glândula não injetada para resultar na formação de tumores, que aborda o perfil de segurança e a preocupação de injeções mal sucedidas em uma mulher de alto risco. Essa técnica tem algumas limitações. Esta é uma técnica de rato relativamente desafiadora que requer destreza e proficiência do operador para manipular e cannular com sucesso cada duto. Cada injeção individual é um evento independente, portanto, a injeção mal sucedida em uma ou mais glândulas pode comprometer a interpretação do resultado. Dado o tamanho da glândula mamária murina e a fragilidade do mamilo, a fluoroscopia ou técnica semelhante de orientação de imagem não está disponível para informar em tempo real quando parar a infusão. Essa orientação de imagem em tempo real será um requisito para a implementação clínica da entrega local de uma solução ablativa.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional de Câncer R21 CA226579 e R01 CA258314 doações ao LFS e pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia R01 EB029418 para a EMS. Gostaríamos de agradecer ao Instituto MSU de Ciência da Saúde Quantitativa (IQ) e instalação do Núcleo de Imagem de Engenharia pelo uso de seus sistemas de imagem e conhecimento técnico. Gostaríamos de agradecer à Dra.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |