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Cancer Research

Somministrazione intraduttale e visualizzazione a raggi X della soluzione ablativa a base di etanolo per la prevenzione e il trattamento locale del cancro al seno in modelli murini

Published: April 01, 2022
doi:
10.3791/63457
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1Precision Health Program,Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine,Michigan State University, 3Department of Pharmacology & Toxicology, College of Veterinary Medicine,Michigan State University, 4College of Osteopathic Medicine,Michigan State University, 5Advanced Materials Characterization Laboratory/Materials Research Center,Missouri University of Science and Technology, 6Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Advanced Molecular Imaging Facility,Michigan State University, 7Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology, College of Human Medicine,Michigan State University, 8Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering,Michigan State University, 9Van Andel Research Institute, 10Miltenyi Biotec, 11Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine,Michigan State University

Summary

Viene descritto un metodo di iniezione intraduttale di reagenti per una soluzione ablativa a base di etanolo all’albero duttale mammario di topo per l’imaging in vivo e la prevenzione del cancro al seno. L’iniezione direttamente nell’apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali mammarie con un danno tissutale collaterale minimo.

Abstract

Il cancro al seno è il cancro più diffuso e la seconda causa di morte correlata al cancro per le donne negli Stati Uniti. Per le donne ad alto rischio, la mastectomia profilattica è la strategia di prevenzione primaria più efficace. La mastectomia profilattica è una procedura chirurgica aggressiva che rimuove completamente le cellule epiteliali mammarie da cui deriva il cancro al seno insieme al tessuto circostante. Cerchiamo di sviluppare una procedura intraduttale minimamente invasiva come alternativa alla mastectomia profilattica per ablare localmente le cellule epiteliali mammarie prima che possano diventare maligne. Noi e altri abbiamo sviluppato una procedura di consegna intraduttale per raggiungere e trattare queste cellule epiteliali in modelli di roditori di cancro al seno. Mentre la ghiandola mammaria del topo con un singolo albero duttale non anastomoso che si apre al capezzolo ha un’architettura molto meno complessa e tortuosa rispetto al seno umano, i modelli murini di cancro al seno indotti chimicamente e geneticamente modificati sono preziosi per produrre studi proof-of-concept di nuove strategie preventive. Qui, descriviamo una procedura per la somministrazione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo contenente un mezzo di contrasto a base di tantalio a raggi MICRO TC / X all’interno dell’albero duttale mammario del topo a scopo terapeutico della prevenzione primaria del cancro al seno. La somministrazione intraduttale di reagenti acquosi (ad es. composti citotossici, siRNA, AdCre) è stata precedentemente descritta in modelli murini. Pertanto, concentriamo la nostra descrizione del protocollo su modifiche metodologiche e considerazioni sperimentali uniche per ottimizzare la consegna di etanolo, per ridurre al minimo gli effetti collaterali locali e sistemici della somministrazione di etanolo e per la visualizzazione in vivo del riempimento dell’albero duttale tramite imaging micro-CT / fluoroscopia. La visualizzazione dell’albero duttale immediatamente dopo l’iniezione di una soluzione contenente contrasto consente di confermare il riempimento completo o risultati non riusciti come il riempimento insufficiente o il riempimento eccessivo. Questa procedura può essere applicata per la consegna e l’imaging di altri composti ablativi volti a prevenire la formazione di tumori o localmente a trattare localmente tumori in fase iniziale accessibili tramite l’albero duttale.

Introduction

Il cancro al seno è una malattia comune e potenzialmente letale con poche opzioni disponibili per la prevenzione1. L’intervento più efficace è la mastectomia profilattica; tuttavia, solo gli individui ad alto rischio scelgono di sottoporsi a questa procedura in quanto si tratta di un intervento chirurgico con importanti conseguenze che cambiano la vita2. La procedura rimuove completamente le cellule epiteliali mammarie da cui deriva il cancro al seno insieme al tessuto circostante. Ciò può comportare stress fisico, psicologico e sociale per l’individuo e spesso dissuade gli individui dal procedere con questa procedura chirurgica come prima linea di intervento primario.

Abbiamo dimostrato che la somministrazione di una soluzione ablativa contenente il 70% di etanolo (EtOH) direttamente nell’albero duttale è efficace nell’uccidere le cellule epiteliali mammarie con danni tissutali collaterali limitati e nel prevenire i tumori al seno nei modelli murini3. EtOH è stato a lungo utilizzato clinicamente come agente ablativo o sclerosante per il trattamento locale. L’iniezione percutanea di EtOH è usata come agente ablativo per tumori epatici non resecabili, neoplasie renali e surrenali e tumori cistici pancreatici4,5,6; per la neurolisi del plesso celiaco per ridurre il dolore7; e per il trattamento di pseudoaneurismi mammari8. L’iniezione intravascolare di EtOH viene utilizzata come agente sclerosante per eliminare gonfiore e deformazione da malformazioni artero-venose (AVM) e per il trattamento cosmetico delle vene varicose e delle vene varicose9,10,11,12,13. Come la mastectomia profilattica, il successo della prevenzione con la somministrazione locale di una soluzione ablativa dipende dalla capacità di rimuovere completamente tutte le cellule epiteliali mammarie da cui il cancro potrebbe potenzialmente derivare. Ciò richiede la conferma che la sostanza ablativa ha riempito con successo l’albero duttale, contattando così direttamente tutte le cellule epiteliali mammarie. Sono prontamente disponibili mezzi clinici per iniettare sostanze all’interno delle ghiandole mammarie e visualizzarle mediante fluoroscopia o duttografia guidata da immagini14,15; pertanto, sarà possibile sia consegnare che confermare il successo della consegna quando questa procedura può giustificare una valutazione negli studi clinici.

Dimostrare la fattibilità di questo approccio guidato da immagini negli animali da laboratorio è un passo fondamentale per stabilire l’efficacia e la fattibilità traslazionale dell’ablazione intraduttale (ID) come misura preventiva per il cancro al seno. Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo per iniettare con successo tutte le ghiandole mammarie nei topi con una soluzione ablativa contenente un mezzo di contrasto nel corso di iniezioni settimanali per garantire che l’animale non soccomba a un sovradosaggio di EtOH (Figura 1, Figura 2, numeri di riferimento.3,16). Questa procedura posiziona un ago da 34 G all’interno dell’apertura del capezzolo di un topo isoflurano-anestetizzato per iniettare la soluzione di prova. Alcuni miglioramenti chiave della procedura includono l’uso di siringhe a tenuta di gas per liquidi e gas, l’iniezione di volumi più elevati per alberi duttali17 e un trattamento antinfiammatorio esteso. Il trattamento preclinico di 5 mg/kg di carprofene, un FANS, da 2 d prima a 7 d dopo la procedura ID è in linea con quello della terapia sclerosante clinica per AVM. Tipicamente, dopo l’anestesia sistemica, i pazienti ricevono farmaci antinfiammatori, come i FANS, per 2 giorni dopo la procedura che possono essere estesi per mitigare qualsiasi infiammazione o dolore locale12. L’intossicazione da alcol è significativamente mitigata dall’iniezione intraperitoneale di una soluzione di saccarosio al 5% nei topi. Con la somministrazione di questa soluzione di saccarosio, i topi possono essere iniettati in modo sicuro con fino a 160 μL di EtOH al 70% (fino a quattro alberi duttali; circa 0,4 g / dL di contenuto di EtOH nel sangue); animali completamente guariti entro 4 ore dopo le iniezioni ID. Per l’iniezione di più di quattro ghiandole nei topi e / o concentrazioni di EtOH più elevate, eseguiamo sessioni sequenziali per consentire un tempo di recupero sufficiente. L’intossicazione da alcol nelle donne sarebbe una preoccupazione minore a causa della minore proporzione di quantità di alcol rispetto al peso corporeo. Dato il numero di alberi duttali nel seno umano14,15, circa 16, e il volume stimato per riempire ogni condotto arboreo18,19, verranno somministrati fino a 32 ml di EtOH al 70%. Questa quantità sarà molto inferiore ai 50 mL di EtOH al 95% somministrati in altre procedure cliniche4,9. La somministrazione endovenosa di tiamina e soluzione di glucosio potrebbe essere utilizzata per ridurre ulteriormente gli effetti dell’intossicazione da EtOH, specialmente nei casi in cui potrebbe essere necessario iniettare un volume totale maggiore di EtOH e/o per le donne che hanno una minore tolleranza al consumo di alcol (ad esempio, varianti alleliche nell’alcol o nell’aldeide deidrogenasi).

L’imaging tramite micro-TC/fluoroscopia ci consente di confermare il successo del riempimento duttale di ciascuna ghiandola (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Questo può essere registrato per analisi future, o valutato al momento tramite imaging fluoroscopico in tempo reale, come sarebbe fatto in applicazione clinica, per limitare il carico complessivo di radiazioni imposto all’animale. Per migliorare ulteriormente le caratteristiche specifiche di questa soluzione ablativa per la somministrazione guidata da immagini in tempo reale in vivo, abbiamo precedentemente confrontato il contrasto contenente iodio approvato dalla FDA con una nanoparticella contenente ossido di tantalio (TaOx) sintetizzata dal laboratorio Shapiro3,16. TaOx ha mostrato prestazioni superiori come agente di contrasto micro-CT per visualizzare il riempimento iniziale dell’albero duttale (Figura 2, Figura 3). TaOx può essere utilizzato come contrasto di riferimento per eseguire una valutazione più sistematica e longitudinale di altri agenti di contrasto del pool sanguigno a base di nanoparticelle (ad esempio, iodio, bismuto o contenenti oro) e la compatibilità di TaOx con diverse concentrazioni di etilcellulosa come agente gelificante20,21.

Protocol

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati condotti secondo protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee presso la Michigan State University. 1. Trattamento antinfiammatorio prolungato Assicurarsi che i topi che ricevono soluzioni per iniezione contenenti EtOH o altre potenziali sostanze irritanti ricevano un trattamento antinfiammatorio da 2 giorni prima dell’iniezione a 7 giorni dopo l’iniezione. Il metodo di dosaggio preferito è la somministrazione orale attraverso una tazza di gel di sucralosio contenente carprofene ad una concentrazione appropriata. Preparare il carprofene con la concentrazione richiesta. Per questo esperimento, una soluzione di lavoro di 2 mg/mL (la soluzione madre è 50 mg/mL) è stata preparata diluendo in PBS sterile per iniettare 0,5 mL per ottenere una dose finale di 1 mg per tazza. Aggiungere l’1% v/v di colorante alimentare blu sterile (BFD) al posto di una frazione del PBS del volume totale necessario per la diluizione per visualizzare meglio la miscelazione completa del farmaco nel gel di sucralosio. Preparare una tazza per l’aggiunta di carprofene secondo la raccomandazione del produttore. Salvo diversa indicazione, posizionare la tazza a bagnomaria a 60 °C per 15 minuti. Rimuovere le tazze e asciugarle per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione. Utilizzare 70% EtOH o una salvietta EtOH per pulire la superficie del coperchio della tazza e lasciare asciugare. Utilizzare una siringa per iniettare la quantità necessaria di soluzione di carprofene attraverso il coperchio. Per questo esperimento, vengono iniettati 500 μL. Coprire il sito di iniezione con un adesivo e agitare vigorosamente per 15 s. Vorticare la tazza per 15 s, quindi conservare per un uso successivo dopo aver verificato visivamente la miscelazione completa. Controllare le tazze per una miscelazione omogenea cercando ciuffi blu scuro. Lasciare che le tazze arrivino a temperatura ambiente prima di passare al frigorifero per la conservazione fino a un mese.NOTA: Queste tazze possono anche essere conservate a temperatura ambiente una volta dosate, se necessario, ma fare attenzione a prestare attenzione alle linee guida sull’efficacia del farmaco da parte del produttore. La datazione dell’adesivo aiuta a tenere traccia della data di iniezione senza rischiare che una penna o un pennarello tagliente fori il coperchio. Quando è pronto per l’uso, pulire l’esterno della tazza con il 70% di EtOH. Staccare il coperchio e posizionare la tazza nella gabbia con i topi. Sostituire le tazze a giorni alterni o quando sono vuote. Una tazza dovrebbe essere sufficiente per un massimo di cinque topi per 1-2 giorni. 2. Preparazione preoperatoria NOTA: Questo passaggio si verifica 2-3 giorni prima dell’iniezione. Anestetizzare il mouse con un vaporizzatore isoflurano (2%-3% isoflurano, 1,5 L/min di ossigeno) e applicare lubrificante per gli occhi. Mantenere l’anestesia all’1% -3% di isoflurano secondo necessità durante la procedura con un cono nasale mentre si monitora attentamente la frequenza respiratoria dell’animale. Applicare il lubrificante per gli occhi degli occhi degli occhi del topo mentre si trova al cono del naso, quindi posizionare il mouse sulla schiena. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare la crema depilatoria da banco sulla zona del capezzolo (l’area della ghiandola mammaria che verrà iniettata). Strofinare la crema nella zona per 10-30 s con l’applicatore per aiutare ad allentare rapidamente la pelliccia.NOTA: Non lasciare la crema sull’animale più a lungo del necessario e rimuovere completamente per evitare di bruciare la pelle. Dopo 10-30 s dell’applicazione, utilizzare acqua tiepida su una garza per rimuovere completamente la crema e allentare la pelliccia dall’animale. Eseguire almeno due o quattro risciacqui dell’area con una garza fresca per la rimozione della crema prima di asciugare con una garza asciutta pulita dopo il risciacquo finale. Controllare l’area di rimozione della pelliccia per confermare una buona visibilità e l’accesso ai capezzoli. Ripetere con l’applicazione di crema depilatoria se necessario. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita e asciutta separata su una piastra riscaldante per recuperare dall’anestesia. Osservare il topo fino a quando non si è completamente ripreso dall’anestesia e riportarlo nella gabbia di casa. Fornire ai topi una tazza di soluzione di gel di sucralosio contenente carprofene (1 mg / tazza) per il pre-dosaggio dell’agente antinfiammatorio dopo il recupero. Una tazza può fornire fino a cinque topi con carprofene per un massimo di 2 giorni. Controllare la tazza ogni giorno e sostituirla secondo necessità, o a giorni alterni se non completamente consumata. 3. Iniezione intraduttale NOTA: Questo passaggio si verificherà 2-3 giorni dopo la preparazione preoperatoria. Preparare la soluzione madre di ossido di tantalio (TaOx) da 333,3 mM di ossido di tantalio (TaOx) dalla formulazione in polvere acquistata come descritto in16 utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Utilizzare calore delicato se la polvere non si dissolve completamente nella soluzione. Crea una soluzione di imaging ablativo mescolando tre parti di stock TaOx con sette parti 100% EtOH per una soluzione finale 70% EtOH 100mM TaOx . Aggiungere il colorante alimentare blu all’1% v/v alla soluzione finale per una visualizzazione assistita durante l’iniezione. Preparare un volume in base alla necessità dell’esperimento.NOTA: le coppie di ghiandole 1 e 5 possono contenere fino a 30 μL della soluzione, mentre tutte le altre coppie possono essere iniettate con un massimo di 50 μL in topi FVB di 9 settimane o più anziani. Anestetizzare il mouse con isoflurano come nella preparazione preoperatoria e spostare il mouse sul cono del naso una volta completamente anestetizzato. Applicare lubrificante per gli occhi prima di posizionare l’animale sulla schiena per l’iniezione. Fissare il mouse sotto lo stereoscopio utilizzando del nastro adesivo, se necessario. Preparare la siringa con il volume desiderato di soluzione iniettabile. Caricare 21-51 μL della soluzione iniettabile in una siringa da 50 μL con un ago da 34 G attaccato. Caricare un ulteriore 1 μL della soluzione per tenere conto della potenziale perdita di quel volume dopo che l’ago è stato rimosso dal capezzolo.NOTA: i volumi di cui sopra sono per le procedure tipiche presentate qui. Si può iniettare qualsiasi volume desiderato con la consapevolezza che la maggior parte delle ghiandole sarà sovraccaricata se si superano i 30 μL o 50 μL nelle coppie di ghiandole 1 e 5, o 2-4, rispettivamente. È utile riempire l’ago con un volume aggiuntivo della soluzione iniettabile per verificare il libero flusso della soluzione immediatamente prima dell’iniezione. Se si inietta più di una ghiandola mammaria, preriempire più siringhe per risparmiare tempo. Tuttavia, non lasciare la soluzione nella siringa a lungo. Preparare i capezzoli per l’iniezione rimuovendo qualsiasi pelle morta che copre l’apertura del capezzolo con una pinza appuntita fine. Tenere delicatamente il capezzolo con una pinzetta. Con la smussatura dell’ago visibile, inserire l’ago nell’apertura del capezzolo fino a quando la smussatura non è completamente coperta con l’aiuto della guida da pinze a punta fine. Potrebbe essere necessario tirare su il capezzolo sull’ago piuttosto che spingere l’ago nel capezzolo (Tabella 1). Una volta che la smussatura dell’ago è completamente circondata dal capezzolo e si trova nel condotto principale, iniziare a iniettare la soluzione ad una velocità costante di circa 40 μL/min. Evitare di iniettare troppo rapidamente per garantire che l’albero duttale non sia danneggiato. Tenere l’ago nel capezzolo per 30 s dopo che il volume è stato completamente iniettato prima di rimuovere l’ago con l’assistenza utilizzando la pinza. Questo viene fatto per evitare che la soluzione fuoriesca dal capezzolo (Figura 2). Valutare l’area per eventuali segni di iniezione non riuscita. Un aspetto a cupola può indicare un’iniezione di cuscinetto di grasso o un trauma nell’area. Procedere all’iniezione delle ghiandole mammarie rimanenti. Mentre l’animale è ancora anestetizzato, iniettare 200-250 μL di soluzione di saccarosio al 5% (fino a 10 ml / kg) per via intraperitoneale per ridurre al minimo i potenziali effetti dell’intossicazione da alcol. 4. imaging micro-CT Dopo aver iniettato tutte le ghiandole desiderate, spostare rapidamente l’animale sul sistema micro-CT e continuare a mantenere l’anestesia utilizzando il vaporizzatore isoflurano incorporato. L’animale può essere registrato per standardizzare la posizione di imaging. Ad esempio, il taping di ogni zampa posteriore in una posizione estesa aiuta a mantenere le ossa delle gambe dell’animale più lontane dalle ghiandole inferiori di interesse nell’immagine risultante.NOTA: Gli animali possono essere ripresi utilizzando diversi parametri di scansione per la visualizzazione dell’albero duttale se si presta attenzione a determinare una dose accettabile appropriata di radiazioni per l’animale e le dosi cumulative non superano questo livello. Le foto e i video della fluoroscopia possono essere generati senza eseguire scansioni per ridurre ulteriormente l’esposizione alle radiazioni (Figura 2). Posizionare il mouse nel campo visivo appropriato con la funzione di anteprima della fluoroscopia. Eseguire l’imaging TaOx dell’albero duttale del topo con una buona risoluzione e l’opportunità di ripetute scansioni di acquisizione standard (2 min). Utilizzare i seguenti parametri di scansione: 90 kVp/88 μA; campo visivo (FOV), 36 mm; numero di fette, 512; spessore fetta, 72 μm; risoluzione voxel, 72 μm3. Acquisisci scansioni ad alta risoluzione più lunghe (4 o 14 minuti) per una risoluzione ancora migliore negli animali. Queste sono accettabili come procedure terminali prima dell’eutanasia. Questi non sono, tuttavia, accettabili per gli animali da scansionare longitudinalmente utilizzando gli stessi parametri in quanto causerà la malattia da radiazioni. Dopo il completamento del protocollo di imaging, rimuovere l’animale dall’anestesia e trasferirlo in una gabbia di recupero separata pulita e asciutta su una piastra riscaldante. Osserva l’animale fino a completo recupero, quindi riportalo nella gabbia di casa. Tenere gli animali iniettati con soluzione ablativa su carprofene fino a 7 giorni dopo l’iniezione. Esegui consegne rapide di qualsiasi immagine scansionata all’interno del software micro-CT (sistema integrato) per apprezzare meglio eventuali perdite di contrasto o mancanza di riempimento (Figura 2) senza analisi formale. Eseguire ulteriori analisi formali delle immagini per la pubblicazione o analisi dettagliata delle scansioni che consentono la segmentazione dell’area di interesse, se lo si desidera (Figura 3).NOTA: la differenza principale tra questi metodi sarà la possibilità di sogliere solo l’albero duttale (copia trasformata formale) rispetto alla necessità di sogliere l’intera immagine (copia trasformata rapida). Altre misurazioni e immagini possono essere generate utilizzando i pacchetti software per dimostrare al meglio il successo del riempimento dell’albero duttale. 5. Analisi delle immagini Eseguire il rendering dell’albero duttale iniettato utilizzando un pacchetto software specializzato. Per fare ciò, segmentare il cuscinetto di grasso mammario con un’ulteriore elaborazione delle immagini. Per segmentare il cuscinetto di grasso (compartimento più scuro rispetto alla cavità peritoneale, ai muscoli femorali e alla pelle) all’interno del quale è contenuto l’albero duttale di interesse, selezionare l’opzione Spline Trace dal menu manuale. Traccia il contorno del cuscinetto grasso ad ogni terza fetta di dati. Fate clic sull’opzione Propaga oggetti (Propagate Objects) dal menu semiautomatico per collegare tutte le sezioni tracciate e non tracciate in un unico oggetto. Selezionare l’opzione Volume soglia dal menu semiautomatico per immettere l’intervallo HU desiderato (300-3.000 HU è un buon punto di partenza), quindi fare clic sul pulsante Copia trasformata soglia per creare una copia trasformata che visualizza solo il contrasto (TaOx) all’interno dell’albero duttale ed elimina i tessuti molli. Attivare o disattivare il pulsante Visualizza su Copia trasformata come principale per visualizzare solo la copia trasformata 3D senza strutture circostanti.NOTA: ulteriori funzioni software consentono di effettuare misurazioni della rappresentazione 3D (ad esempio, lunghezza, volume, ecc.).

Representative Results

I topi femmina hanno cinque paia di ghiandole mammarie con un singolo albero duttale che si apre all’orifizio del capezzolo22. Alle punte dell’albero duttale in via di sviluppo ci sono le gemme terminali (TEB), strutture proliferative che dirigono la crescita e la ramificazione. Dopo la pubertà, quando la fase di allungamento è completata, i TEB regrediscono e diventano funzionalmente e anatomicamente indistinguibili dai dotti terminali o dalle gemme alveolari23. Le unità lobulari duttali terminali svolgono una funzione simile nell’uomo come fanno i TEB nei topi e sono i siti da cui deriva prevalentemente il cancro al seno24,25. Possiamo iniettare fino a 50 μL di soluzione di EtOH al 70% per riempire l’intero albero duttale delle ghiandole mammarie toraciche e addominali di FVB/N, NSG e altri ceppi di topo di 9 settimane (Figura 1, Figura 2, Figura 3, vedi riferimenti3,16). In un esperimento tipico, possiamo iniettare fino a otto ghiandole mammarie con una soluzione ablativa di EtOH al 70% e 100 mM TaOx in due procedure ID consecutive separate da 7 giorni per consentire il recupero degli animali (Figura 2). Gli animali vengono ripresi mediante micro-TC immediatamente dopo l’ultima iniezione ID per valutare il successo della somministrazione della soluzione all’intero albero duttale (Figura 2). Nella nostra esperienza, i capezzoli delle ghiandole inguinali sono adatti per l’iniezione in circa il 60% degli animali e i capezzoli delle ghiandole cervicali in circa il 40%. Quando appropriato, possiamo iniettare fino a 30 μL di soluzione di EtOH al 70% per riempire l’intero albero duttale delle ghiandole mammarie cervicali e inguinali (Figura 2). I ceppi FVB e NSG presentano generalmente capezzoli più adatti per l’iniezione rispetto a C57BL/6J o ceppi misti di fondo genetico. Il protocollo di doppia colorazione a doppio supporto intero o la microscopia confocale 3D sono buoni metodi ortogonali per confermare fino a che punto l’albero duttale è stato riempito (Figura 3). Queste analisi tissutali correlate sono compatibili e possono essere eseguite dopo l’imaging in vivo. L’ovvia limitazione di questi metodi ortogonali è che richiedono la terminazione animale per la raccolta e l’analisi dei tessuti; tuttavia, in una fase di ottimizzazione di una nuova formulazione ablativa, forniscono una convalida indipendente. Figura 1: Flusso di lavoro della procedura intraduttale e analisi delle immagini. I passaggi chiave della procedura di identificazione sono evidenziati. Si prega di vedere il video per maggiori dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Cannulazione riuscita e consegna di soluzione ablativa a più ghiandole mammarie. (A) Variegatura rappresentativa del capezzolo nei ceppi di topo FVB e NSG. I capezzoli lunghi sono più facili da cannulare rispetto ai capezzoli corti, mentre i capezzoli troppo corti o vestigiali non possono essere cannulati. Una volta cannulata, la dimensione del capezzolo non influisce sul successo della consegna intraduttale. (B) L’analisi anatomica grossolana del colorante blu in una soluzione ablativa fornisce prove ex vivo del riempimento dell’albero duttale e del successo della consegna. (C,D) La fluoroscopia in tempo reale e la resa micro-CT 3D post-acquisizione immagini forniscono prove in vivo del successo della consegna. (D) Iniezione riuscita di entrambe le ghiandole addominali e inguinali e tre ghiandole toraciche su quattro (iniezione di cuscinetto di grasso nella ghiandola n. 2). Le barre di scala corrispondono a 1 mm nelle immagini con ingrandimenti diversi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Dimostrazione in vivo ed ex vivo del riempimento di alberi duttali. 70% EtOH/100 mM TaOx nanoparticelle/soluzione di Evans Blue è stata iniettata per via intraduttale nella ghiandola mammaria addominale del topo e immediatamente fotografata da micro-CT ed elaborata per la colorazione a doppio supporto intero. L’albero duttale è stato ricostruito utilizzando un pacchetto software di analisi delle immagini. La soluzione riempie interamente l’albero duttale macchiato di allume carminio. Una ghiandola separata è stata immunocolorata per E-Caderina (Cdh1), eliminata usando Benzil alcool:Benzil Benzoato e fotografata al microscopio confocale come descritto26. L’albero duttale è stato ricostruito utilizzando un software di analisi delle immagini. La resa pseudo-colorante dell’immagine confocale (cioè da sfondo nero a bianco, segnale di marcatore verde a magenta) è stata ottenuta con la funzione di inversione dell’immagine del software di editing delle immagini. Le barre di scala corrispondono a 1 mm nelle immagini con ingrandimenti diversi. Questa cifra è stata modificata dal riferimento n.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Questione Apparenza Soluzione Capezzolo corto (Fig. 2) Il capezzolo ha un profilo basso – difficile da afferrare A volte è più facile tenere la pelle vicino al capezzolo e mirare al centro del capezzolo con l’ago. L’ago probabilmente si tufferà sotto la pelle. Tirare lentamente può rivelare che il capezzolo è leggermente sopra la punta dell’ago e dare spazio per afferrarlo e tirarlo per il resto della strada sull’ago. Fai molta attenzione quando ti immergi sotto la pelle sull’angolo dell’ago. È facile ottenere inavvertitamente un’iniezione di grasso pugnalando con l’angolazione sbagliata. Capezzolo grasso Molto più grande di altri capezzoli con poca pelle morta pelabile – facilmente visibile senza scopo Molto facile ottenere un’iniezione di cuscinetto di grasso su questi capezzoli. Sii molto cauto sull’angolo dell’ago quando inserisci nel capezzolo. Iniezione di grasso (Fig. 2) Gonfio intorno al capezzolo e possibilmente nel capezzolo stesso – più facile vedere se il colore viene aggiunto alla soluzione iniettabile Se il capezzolo si gonfia con i primi ul iniettati, rimuovere l’ago e tentare di inserire di nuovo con maggiore attenzione all’angolo. Ricominciare l’iniezione e guardare per ulteriore gonfiore. Se il gonfiore continua, abbandona il tentativo. È molto raro iniettare con successo un capezzolo che è iniziato come iniezione di cuscinetto di grasso. Ferite/croste Ferita aperta o crosta vicino al sito di iniezione della soluzione di EtOH Applicare un unguento antibiotico triplo per aprire le ferite ma lasciare le ferite scroste da sole. L’applicazione di unguento alle croste può aumentare la probabilità che l’animale infastidisca la crosta e la rimuova. Controllare ogni 1-2 giorni fino alla guarigione a seconda della gravità della ferita. Il carprofene deve essere somministrato fino alla guarigione anche se oltre la normale finestra. Tabella 1: Risoluzione dei problemi e suggerimenti utili.

Discussion

La mastectomia profilattica è attualmente l’intervento più efficace per il cancro al seno, ma ha alcuni gravi impatti negativi. L’ablazione locale di cellule epiteliali mammarie con una soluzione a base di EtOH è una terapia alternativa promettente, come abbiamo dimostrato in uno studio proof-of-concept sul modello murino aggressivo FVB-Tg-C3(1)-TAg del cancro al seno3. L’iniezione ID di questa soluzione ablativa consente di colpire le cellule epiteliali mammarie da cui deriva il cancro al seno con danni collaterali limitati. L’aggiunta di un mezzo di contrasto a raggi X alla soluzione ablativa consente una migliore comprensione dell’efficacia della soluzione alla prevenzione, poiché possiamo vedere se ogni albero duttale viene riempito con successo dopo l’iniezione (Figura 2B). La visualizzazione delle ghiandole iniettate mediante fluoroscopia immediatamente dopo l’iniezione rispecchia ciò che probabilmente verrà fatto in clinica per confermare il successo del riempimento dell’albero duttale. La conferma visiva della consegna della soluzione informerà al meglio se tutte le parti dell’albero sono state raggiunte in tempo reale. Ciò potrebbe consentire di eseguire un’ulteriore iniezione per completare il riempimento al momento o in una sessione futura. È di grande importanza che la soluzione ablativa raggiunga tutte le parti dell’albero duttale per garantire che tutte le cellule epiteliali siano accessibili per l’uccisione (Figura 3). Lasciarsi alle spalle cellule epiteliali viventi all’interno dell’albero consentirebbe la possibilità che il cancro al seno possa ancora insorgere. L’utilizzo del contrasto nelle iniezioni ID per il successo dell’immagine dell’iniezione potrebbe essere utile anche per altre formulazioni. La Tabella 1 fornisce la risoluzione dei problemi e suggerimenti utili. Altri studi hanno descritto protocolli di consegna ID per particelle virali (ad esempio, AdCre, RNA guida CRISPR), ormoni, composti citotossici, siRNA e/o agenti bersaglio nei topi3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, ratti24,32,39,40,41 e conigli42,43,44,45,46,47. Studi clinici indipendenti hanno riportato un successo nella cannulazione fino a otto dotti per seno per la somministrazione locale di chemioterapia40,48,49. Visualizzare il riempimento completo quando si forniscono altre soluzioni mirate alla prevenzione o orientate al trattamento sarebbe utile per ragioni simili. La consapevolezza che la soluzione ha raggiunto tutti i rami e le estremità terminali dell’albero sarà informativa nella valutazione della prevenzione o del trattamento di successo.

Non siamo a conoscenza di altri metodi di imaging intraduttale nei topi33,34 o in altri modelli animali47 che consentano l’alta risoluzione delle nanoparticelle TaOx. Da notare, TaOx nell’albero duttale murino supera gli agenti di contrasto approvati dalla FDA per la duttografia diagnostica3,16. Mentre continuiamo a valutare la procedura ablativa ID per la sua capacità di prevenire il cancro al seno, saremo in grado di determinare più precisamente da quali ghiandole sorge il cancro con l’aiuto di dati aggiuntivi forniti attraverso l’imaging dopo il parto ID. Ad esempio, si potrebbe determinare se una ghiandola che è stata riempita solo parzialmente è più probabile di una ghiandola non iniettata per provocare la formazione di tumori, che affronta il profilo di sicurezza e la preoccupazione di iniezioni infruttuose su una donna ad alto rischio. Questa tecnica ha alcune limitazioni. Questa è una tecnica mouse relativamente impegnativa che richiede destrezza e competenza dell’operatore per manipolare e cannulare con successo ogni condotto. Ogni singola iniezione è un evento indipendente, quindi l’iniezione non riuscita su una o più ghiandole può compromettere l’interpretazione del risultato. Date le dimensioni della ghiandola mammaria murina e la fragilità del capezzolo, la fluoroscopia o una tecnica simile di guida dell’immagine non è disponibile per informare in tempo reale quando interrompere l’infusione. Questa guida alle immagini in tempo reale sarà un requisito per l’implementazione clinica della consegna locale di una soluzione ablativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal National Cancer Institute R21 CA226579 e R01 CA258314 sovvenzioni a LFS e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 sovvenzione a EMS. Vorremmo ringraziare la struttura MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core per l’uso dei loro sistemi di imaging e competenze tecniche. Vorremmo ringraziare la dottoressa Danielle Ferguson per aver esaminato i contenuti del video e le cifre per l’aderenza alle linee guida sul benessere degli animali.

Materials

AnalyzeDirect v12.0 Caliper n/a For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL Allivet 50647 For anti-inflammatory treatment
Evans blue Sigma E2129-50G For injection visualization
Hot water bath Toolots Yidu_HH-S2 For preparing carprofen cups
Imaris Bitplane n/a For confocal image processing
MediGel Sucralose Cups ClearH2O 74-02-5022 For delivery of carprofen
Model 1705 RN Syringe, 50μL Hamilton 7655-01 For intraductal injection
Photoshop 2021 Adobe n/a For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System Perkin Elmer CLS149276 For micro-CT image acquisition
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) Hamilton 207434 For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series AmScope SM-4TPZ-144 For intraductal injection
Sterile blue food dye McCormick 930641 For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher 14190250 For solution preparation
Stickers DOT Scientific DOTSCI-C50 For preparing carprofen cups
Sucrose Calbiochem 8550-5KG For intraductal injection
Syringes Fisher 14-826-79 For preparing carprofen cups
Vortex VWR 10153-834 For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s) Braintree Scientific HTP-1500 120V; AP-R 26E For intraductal injection/preoperative preparation
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Kenyon, E., Zaluzec, E. K., Powell, K., Volk, M., Chakravarty, S., Hix, J., Arora, R., Westerhuis, J. J., Kiupel, M., Shapiro, E. M., Sempere, L. F. Intraductal Delivery and X-ray Visualization of Ethanol-Based Ablative Solution for Prevention and Local Treatment of Breast Cancer in Mouse Models. J. Vis. Exp. (182), e63457, doi:10.3791/63457 (2022).
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