マウスモデルにおける乳癌の予防および局所治療のためのエタノールベースのアブレーション溶液の管内送達およびX線可視化

ここに記載されているすべての実験は、ミシガン州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施されました。 1.拡張抗炎症治療 EtOHまたは他の潜在的な刺激物を含む注射溶液を受けているマウスに、注射の2日前から注射後7日まで抗炎症処置が施されていることを確認する。投薬の好ましい方法は、カルプロフェンを適切な濃度で含むスクラロースゲルカップを介した経口送達である。 必要な濃度でカルプロフェンを準備する。この実験のために、滅菌PBSで希釈して0.5mLを注入することによって、2mg/mLの作業溶液(原液は50mg/mL)を調製し、1カップあたり1mgの最終用量を達成した。希釈に必要な全容量のPBSの画分の代わりに1% v/v滅菌青色食用色素(BFD)を加えて、スクラロースゲルへの薬物の完全な混合をよりよく視覚化します。 メーカーの推奨に従ってカルプロフェン添加用のカップを準備します。特に推奨されない限り、カップを60°Cの水浴中に15分間置きます。カップを取り出し、汚染の可能性を最小限に抑えるためにそれらを乾燥させます。 70%のEtOHまたはEtOHワイプを使用して、カップの蓋の表面をきれいにし、乾燥させます。シリンジを使用して、必要な量のカルプロフェン溶液を蓋から注入する。この実験のために、500μLを注射する。注射部位をステッカーで覆い、15秒間激しく振る。 カップを15秒間渦巻き、完全な混合を視覚的に確認した後、後で使用するために保管します。濃い青色の塊を探して、カップに均質な混合がないか確認してください。カップを室温にしてから冷蔵庫に移動し、最大1ヶ月間保管してください。注:これらのカップは、必要に応じて一度投与すると室温で保存することもできますが、メーカーからの薬効ガイダンスに注意を払うように注意してください。ステッカーをデートすると、ペンや鋭いマーカーが蓋を突き刺す危険を冒すことなく、注射日を追跡するのに役立ちます。 使用する準備ができたら、カップの外側を70%EtOHで拭き取ってください。蓋をはがし、マウスと一緒にカップをケージに入れます。カップは1日おきに、または空になったときに交換してください。1カップは1〜2日間最大5匹のマウスに十分であるべきです。 2. 術前準備 注:このステップは、注射の2〜3日前に行われます。 イソフルラン気化器(2%〜3%のイソフルラン、酸素1.5L /分)を使用してマウスを麻酔し、眼の潤滑剤を塗布する。動物の呼吸数を注意深く監視しながら、鼻錐体による手順全体を通して必要に応じて麻酔を1%〜3%イソフルランで維持する。 鼻円錐形にいる間にマウスの目に目の潤滑剤を塗布し、マウスを背中に置きます。綿の先端をあけたアプリケーターを使用して、乳首領域(注入される乳腺の領域)に店頭脱毛クリームを塗布します。アプリケーターでクリームを10〜30秒間こすりつけて、毛皮をすばやく緩めるのを助けます。注:クリームを必要以上に動物に残さず、皮膚を燃やさないように完全に取り除いてください。 塗布の10〜30秒後、ガーゼに温水を使用してクリームを完全に取り除き、動物から毛皮を緩めます。クリーム除去のために新鮮なガーゼでその領域を少なくとも2〜4回すすぎ、最終的なすすぎの後にきれいなドライガーゼで乾燥させる。毛皮の除去の領域をチェックして、良好な視認性と乳首へのアクセスを確認してください。必要に応じて脱毛クリームを塗布して繰り返します。 マウスを加熱パッド上の別の清潔で乾いた回復ケージに入れ、麻酔から回復します。麻酔から完全に回復するまでマウスを観察し、自宅のケージに戻します。 回復後の抗炎症剤の予備投与のために、カルプロフェン(1mg /カップ)を含むスクラロースゲル溶液を1カップでマウスに提供する。1カップで最大5匹のマウスに最大2日間カルプロフェンを提供することができます。カップを毎日チェックし、必要に応じて交換するか、完全に消費されていない場合は1日おきに交換してください。 3. 管内注射 注:このステップは、術前準備の2〜3日後に行われます。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いてin16に記載されるように調達した粉末製剤から333.3 mM酸化タンタル(TaOx)原液を調製する。粉末が溶液に完全に溶解しない場合は、穏やかな暖かさを使用してください。 3つの部分ストックTaOx と7つの部分100%EtOHを混合してアブレーションイメージング溶液を作り、最終的な70%EtOH 100mM TaOx溶液 を得る。1% v/v青色の食品色素を最終溶液に加え、注射中の可視化を支援します。実験の必要性に基づいてボリュームを準備します。注:腺ペア1および5は最大30μLの溶液を保持できますが、他のすべてのペアは9週齢以上のFVBマウスで最大50μLを注射できます。 術前調製のようにイソフルランでマウスを麻酔し、完全に麻酔をかけたらマウスを鼻円錐形に移動する。注射のために動物を背中に置く前に、目の潤滑剤を塗布してください。必要に応じて、テープを使用してマウスをステレオスコープの下に固定します。 所望の量の注射液でシリンジを準備する。21~51 μLの注射液を、34 G針を取り付けた50 μLのシリンジにロードします。ニードルを乳首から取り外した後のその体積の潜在的な漏れを考慮して、溶液を1μL余分にロードする。メモ: 上記のボリュームは、ここで説明する一般的な手順用です。腺対1および5、または2〜4においてそれぞれ30μLまたは50μLを超えると、ほとんどの腺が過充填されることを理解して、任意の体積を注入することができる。注射の直前に溶液の自由な流れをテストするために、注射溶液の追加容量で針を充填することは有用である。複数の乳腺を注射する場合は、時間を節約するために複数の注射器をプレフィルしてください。ただし、溶液をシリンジに長時間放置しないでください。 細かい尖った鉗子で乳首の開口部を覆っている古い皮膚を取り除くことによって、注射のために乳首を準備します。 ピンセットで乳首を優しく持ちます。針のベベルが見える状態で、ベベルが先端の細かい鉗子からのガイダンスヘルプで完全に覆われるまで、ニードルを乳首の開口部に挿入します。針を乳首に押し込むのではなく、乳首を針の上に引き上げる必要があるかもしれません(表1)。 針のベベルが乳首によって完全に囲まれ、メインダクトに入ったら、約40μL/minの安定した速度で溶液を注入し始める。ダクトツリーが損傷していないことを確認するために、あまりにも速く注入しないでください。鉗子を使用して助けて針を取り外す前に、体積が完全に注入された後、30秒間乳首に針を保管してください。これは、溶液が乳首からこぼれ落ちないようにするために行われます(図2)。 注射が失敗した兆候がないか領域を評価します。ドーム型の外観は、脂肪パッド注射またはその領域への外傷を示し得る。 残りの乳腺を注射する。 動物がまだ麻酔をかけている間、アルコール中毒の潜在的な影響を最小限に抑えるために、200〜250μLの5%スクロース溶液(最大10mL / kg)を腹腔内に注射する。 4. マイクロCTイメージング すべての所望の腺を注入した後、動物をマイクロCTシステムに迅速に移動し、組み込まれたイソフルラン気化器を使用して麻酔を維持し続ける。動物は、画像化位置を標準化するためにテープで固定されてもよい。例えば、各後肢を延長された位置にテーピングすることは、動物の脚の骨を、結果として得られる画像において関心のある下腺から遠ざけるのに役立つ。注:動物に適切な許容可能な生涯放射線量を決定するために注意が払われ、累積線量がこのレベルを超えない場合、乳管樹の視覚化のための異なるスキャンパラメータを使用して動物を画像化することができる。透視静止画やビデオは、スキャンを行わずに生成できるため、放射線被ばくをさらに低減できます(図2)。 蛍光透視プレビュー機能を使用して、マウスを適切な視野に配置します。 マウスの乳管樹のTaOx イメージングを、良好な解像度と、標準(2分)の取得スキャンを繰り返す機会で実行します。次のスキャンパラメータを使用します: 90 kVp/88 μA;視野(FOV)、36ミリメートル。スライス数、512;スライスの厚さ、72μm;ボクセル分解能、72 μm3。 より長い(4分または14分)高解像度スキャンを取得して、動物の解像度をさらに向上させます。これらは安楽死の前の最終処置として受け入れられます。しかし、これらは、放射線病を引き起こすのと同じパラメータを使用して動物を縦方向にスキャンすることは受け入れられません。 イメージングプロトコルの完了後、動物を麻酔から取り出し、加熱パッド上の別の清潔で乾いた回収ケージに移します。完全に回復するまで動物を観察し、それからそれを家のケージに戻してください。動物をカルプロフェンのアブレーション溶液を注射後7日まで注射し続けます。 micro-CTソフトウェア(内蔵システム)内でスキャンした画像をすばやくレンディションして、正式な分析を行わなくてもコントラストの漏れや充填不足(図2)をよりよく理解できます。 必要に応じて、対象領域のセグメンテーションを可能にするスキャンの公開または詳細な分析のために、さらに正式な画像解析を実行します(図3)。注: これらの方法の主な違いは、ダクタル ツリーのみをしきい値に設定する機能 (正式なレンディション) と、イメージ全体をしきい値に設定する必要があること (クイック レンディション) です。他の測定値および画像は、乳管樹木充填の成功を最もよく実証するために、ソフトウェアパッケージを使用して生成され得る。 5. 画像解析 特殊なソフトウェアパッケージを使用して、注入された管状ツリーのレンダリングを実行します。これを行うには、乳房脂肪パッドをさらに画像処理してセグメント化します。 目的の管状樹が含まれる脂肪パッド(腹腔、大腿骨筋、および皮膚と比較して暗いコンパートメント)をセグメント化するには、手動メニューから 「スプライントレース」 オプションを選択します。ファットパッドのアウトラインを 3 番目のデータ スライスごとにトレースします。 半自動メニューから 「オブジェクトの伝達」 オプションをクリックして、トレースされたスライスとトレースされていないスライスをすべて 1 つのオブジェクトに接続します。 半自動メニューから [音量のしきい値] オプションを選択して目的の HU 範囲 (300 ~ 3,000 HU が適切な開始点) を入力し、[レンディションのしきい値] ボタンをクリックして、管状ツリー内のコントラスト (TaOx) のみを表示し、軟部組織を除去するレンディションを作成します。 [表示] ボタンを [レンディションをプライマリとして] に切り替えて、周囲の構造物なしで 3D レンディションのみを表示します。メモ: 追加のソフトウェア機能を使用すると、3D レンディション (長さ、体積など) を測定できます。