Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunobead Multianalyte para Covid-19

Resultados típicos de ensaios e avaliações de desempenhoOs ensaios de imunoesferas geralmente fornecem uma curva sigmoidal quando avaliados sobre várias ordens (log) de magnitude, como ilustrado em cada um dos painéis apresentados na Figura 1. O usuário deve definir experimentalmente a faixa de concentração ideal para cada analito no multiplex para determinar toda a gama de quantitação, garantindo não sobrepernaturar os extremos (áreas que se aproximam do limite inferior de quantitação [LLOQ] ou limite superior de quantitação [ULOQ]). A faixa real necessária para um ensaio, no entanto, é ditada pela distribuição dos analitos alvos em uma matriz biológica (ou seja, as ‘incógnitas’) em um determinado fator de diluição. Além disso, embora as curvas padrão sejam tipicamente interpretadas via regressão linear com um algoritmo de ajuste 4 ou 5 paramétricos, a porção linear de uma determinada curva normalmente fornece a maior confiança na precisão quantitativa com um modelo linear (y = mx + b) de quantitação. A correspondência da curva de calibração com os valores observados para um desconhecido em um determinado fator de diluição deve ser o objetivo no desenvolvimento de ensaios quantitativos. A este respeito, uma curva padrão de 7 pontos baseada em uma série de diluição serial de 1:5 foi avaliada para cada um de Spike S1, Anticorpos nucleocapsídeos e membranas que variam entre 1 μg/mL e 0,000064 μg/mL para Spike S1 e Nucleocapsid e 5 μg/mL e 0,00032 μg/mL para membrana, como mostrado na Figura 1. O limite inferior de detecção (LLOD) para cada ensaio foi definido como a menor concentração de analitos que produziu um sinal distinguível de seu fundo. O LLOD pode ser identificado pela equação descrita anteriormente 8,9, LLOD = LoB + 1.645 (amostrade baixa concentração de SD). LoB é o limite inferior do espaço em branco, e é a concentração “aparente” de analito que é produzido a partir do branco quando um valor zero é esperado, e pode ser verificado usando esta equação LoB = Médiaem branco + 1.645 (SDem branco)8. Com base nesse método, os valores de MEF para o ensaio Spike S1 variaram de 134,38 a 20191.2, com 134,38 MFI representando 0,00024 μg/mL e definido como LLOD. Para o ensaio de membrana, a faixa prática de IFI foi de 52,24 a 4764,9, com 52,24 MFI calculados para 0,004885 μg/mL e atribuídos como LLOD. A faixa de IMfi para o ensaio nucleocapsídeo foi de 517,9 a 19666,34, com 517,9 especificados como 0,00024 μg/mL, que foi o LLOD. O limite superior de detecção (ULOD) é definido como a concentração de analito após o qual a mudança no IMFI não é mais linear, e a resposta ao sinal está saturada. Deve-se notar que o caráter sigmoidal completo dessas curvas não é observável para os padrões testados, com exceção da curva Nucleocapsid. No entanto, dado os valores de IFI observados para todas as incógnitas avaliadas até o momento (em uma diluição de 1:500) estão dentro da faixa de curva apresentada para cada analito e são facilmente quantificados usando um ajuste paramétrico de 4 ou 5 via regressão linear. Precisão de ensaioPrecisão intra-ensaio: Quatro réplicas de ensaios foram realizadas na mesma placa para avaliar a precisão do ensaio, calculada como %CV, ou o quociente do desvio padrão e a média multiplicada por 100. Os pontos padrão 2 e 5 foram selecionados para essas tabulações, com valores catalogados na Tabela 2. O limite limite superior aceitável típico para valores %CV é ≤20%, o que foi observado para esses dados, com exceção ao padrão 2 do IgG de Membrana, que provavelmente resulta dos níveis de fundo e pode ser corrigido eliminando valores peraquáveis (dados não mostrados). Deve-se notar que observou-se uma aparente instabilidade para o valor de leitura para ensaios de membrana onde os valores de FI foram <200, mais comumente no caso de isótipos IgA e IgM. Precisão de ensaio inter- ensaio: Três lotes distintos de conjuntos de contas foram preparados para cada ensaio e testados, conforme definido para precisão intra-ensaio (acima e como visto na Figura 1). A variabilidade do ensaio interseto foi avaliada pelo cálculo do %CV a partir dos resultados médios de cada um dos três lotes, conforme mostrado na Tabela 3. Novamente, o limite superior para um %CV aceitável é fixado em ≤20%, o que existe para todas as condições testadas (com efeito semelhante com o padrão 2 de IgG de membrana, como visto acima). Deve-se notar que a variabilidade em lote a lote nos valores de MFI líquidos é comumente observada dentro de vários lotes dos mesmos imunorreagentes durante o desenvolvimento de ensaios personalizados. O uso de uma curva de calibração erguida a partir de um anticorpo anti-alvo obtido comercialmente (por exemplo, anti-Spike S1) seguido por um anticorpo de detecção de antiespécies pode fornecer consistência nos resultados analíticos e permitir comparações entre vários lotes em diferentes períodos de tempo. Precisão de ensaio com amostras humanas: A avaliação da precisão entre ensaios foi repetida com amostras de plasma humano (n = 5) coletadas dentro de um mês dos sintomas relatados pela primeira vez para uma infecção por SARS-CoV-2; realizados com três lotes distintos de ensaios (ou seja, diferentes preparações dos conjuntos de contas). Esses resultados são retratados na Tabela 4 e demonstram precisão com um valor %CV com o valor limite superior típico de ≤20%. Os valores médios %CV para os títulos De Nucleocapsid e Membrana IgG foram calculados em 9,9% (faixa 2,6%-18%), 11,0% (faixa 3,5%-24,4%) e 7,6% (faixa 3,2%-12,9%), respectivamente. Observações semelhantes foram feitas com os títulos IgM e IgA desses três analitos, todos fornecendo valores %CV <20%. A única exceção a isso foi o assunto 5 títulos IgM para a proteína membrana, que foi posteriormente excluído como um outlier. Os valores de precisão para as avaliações do sujeito humano são consistentes com os vistos acima para os anticorpos de coelho, o que sugere que esses ensaios podem ser prontamente reconfigurados para avaliar os títulos dos antígenos em várias espécies com pouco impacto na precisão do ensaio. Como observado acima, houve uma aparente instabilidade na leitura de valores observados para ensaios de membrana onde os valores de FI foram <200, mais comumente no caso de isótipos IgA e IgM. Otimização da concentração de anticorpos primáriosO “tempo de captura” analito foi avaliado com as contas conjugadas por antígeno, e os anticorpos nos espécimes de plasma ou nos padrões foram testados modificando o comprimento da incubação primária (30 min, 1 h, 2 h e 4h). A diferença na média de IM é apresentada como quociente de uma incubação específica e do tempo máximo de incubação, denominado % Max., na Figura 2, entre uma incubação de 30 min (duração mínima) e uma incubação de 4h (duração máxima). Os valores em 120 min foram ideais para os títulos IgG para os corpos spike S1, a membrana e os anticorpos nucleocapsídeos, indicando uma cinética de ligação de anticorpos de forma primária rápida, permitindo flexibilidade para aumentar o throughput do ensaio. No entanto, cinéticas mais lentas foram observadas para os isótipos IgA e IgM (dados não mostrados), demonstrando níveis de pico de captura no ponto de tempo de 4h, como mostrado na Figura 2. No geral, há um equilíbrio entre a aproximação da saturação do ensaio e a conveniência de tempo prática para executar cada ensaio quando em produção (para maximizar o throughput). Com isso, foram observados sinais adequados para fins quantitativos em tempos mínimos de incubação de 30 minutos para IgG, 60 min para IgM e 120 min para IgA. Otimização da concentração de anticorpos secundáriosForam testadas cinco concentrações de anticorpos secundários (IgG anti-humano de cabra, conjugado por PE; IgA anti-humano de cabra, conjugado por Pm; IgM anti-humano de cabra, conjugado pela SB) (0,5, 1, 2, 4 e 8 μg/mL). Todos os anticorpos revelaram amplas faixas de sinal, sem saturação de sinal óbvio em nenhuma condição, garantindo assim uma medição linear para qualquer uma das concentrações. Como exemplo, o sinal médio gerado a partir do ensaio Spike S1 utilizando IgM anti-humano de cabra, SB conjugado a 0,5 μg/mL foi de 13,2% do MFI gerado a partir do sinal máximo (8 μg/mL), enquanto a FI gerada a partir de 4 μg/mL foi de 73,3% do MFI manifestado no sinal máximo. Detalhes da gama de sinais dos outros isótipos de anticorpos Spike S1, os anticorpos de membrana e os anticorpos nucleocapsídeos estão incluídos na Tabela 5 e Figura 3. Como ponto prático, o impacto primário entre a concentração de anticorpos secundários ideal e a concentração de anticorpos secundários de 4 μg/mL anteriormente declarada é refletido em termos de sensibilidade de ensaio e custo de ensaio. Ou seja, uma concentração de anticorpos secundários de 8 μg/mL pode ser desejável para aplicação com títulos de anticorpos baixos ou baixas quantidades de amostra valiosa, mas o custo associado a esses ensaios seria consideravelmente maior do que o uso da concentração de 4 μg/mL previamente definida. Inversamente, casos em que seriam observados altos títulos de anticorpos (como indivíduos que experimentaram vacinas Covid-19 ou com quantidades não limitantes de soro) veriam um custo-benefício através da aplicação das menores quantidades de anticorpos secundários (por exemplo, 1 μg/mL). Otimização da incubação de anticorpos secundáriosA influência potencial da duração da incubação de anticorpos secundários também foi investigada pela modificação do comprimento da incubação (15, 30, 60 e 120 min). Geralmente, a diferença na média do IFI apresentada como quociente de uma incubação específica e o tempo máximo de incubação, denominado %Max, entre uma incubação de 15 min (duração mínima) e uma incubação de 120 min (duração máxima) não excedeu 30%, 55% e 50% para o Spike S1, a Membrana e os anticorpos nucleocapsídeos, respectivamente, indicando um passo cinético rápido na ligação de anticorpos secundários e um meio de aumentar a produtividade do ensaio. A Tabela 6 inclui detalhes sobre as alterações de sinal para todos os tempos de incubação. Ilustrações dos sinais observados de diferentes incubações desta análise são mostradas na Figura 4. Desempenho e especificidade de dois canaisPara cada analito, uma única execução de formato de repórter (somente IgG-PE, somente IgA-PE ou somente IgM-SB) foi comparada ao sinal gerado para o mesmo analito quando foi executado em um formato de dois repórteres (por exemplo, Spike S1 IgG-PE apenas contra Spike S1 IgG-PE em combinação com Spike S1 IgM-SB no formato de dois repórteres). A precisão do ensaio (expressa como %CV) para os sinais criados nos dois formatos foram utilizadas para analisar a relação nos achados deste experimento. Os valores %CV dos ensaios Spike S1 foram de 6,19%, 16,4% e 23% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Para o ensaio de membrana, os valores %CV foram de 3,3%, 7,9% e 16,4% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Por fim, o ensaio nucleocapsídeo forneceu valores %CV em 8,7%, 10,3% e 24,2% para IgM, IgG e IgA, respectivamente. Os valores de precisão observados para os isótipos IgM e IgA sugerem que um tempo de incubação mais longo pode conferir resultados superiores de ensaio devido às diferenças cinéticas de ligação conhecidas entre essas classes de imunoglobulinas. A Figura 4 mostra a concordância entre os formatos de diferentes concentrações de anticorpos secundários. Para confirmar a especificidade dos canais de repórteres, um único canal de repórteres foi testado em um momento, enquanto o outro canal foi designado como um espaço em branco para saber sobre o sinal não específico (efeito sangramento). Esses achados indicam que há uma contaminação insignificante de sinais cruzados entre os dois canais de repórteres, dada a alta especificidade em todo o espectro de condições. Estes achados são ilustrados na Figura 5. No geral, observamos uma interferência de 6,45% entre o canal 1 e o canal 2. No entanto, quando a magnitude dos sinais foi contabilizada, observamos os seguintes níveis potenciais de interferência no modo de dois repórteres: Spike IgG/ IgM em 71,98%, Spike IgA/ IgM em 28,11%; Membrana IgG/IgM a 7,41%, Membrana IgA/ IgM a 134,61%; e Nucleocapsid IgG/ IgM em 146,03%, Nucleocapsid IgA/ IgM em 112,13%. Na configuração especificada, isso exigiria a medição do Spike IgM em combinação com o isótipo IgA, IgM de membrana com o isótipo IgM e medições nucleocapsid não realizadas em formato de canal duplo. Esse achado pode exigir a exploração da inversão da estratégia de rotulagem pela qual o IgA e o IgG sejam medidos no canal 2 e IgM no Canal 1. Avaliação de eventos de soroconversão após a vacinação covid-19A soroconversão foi monitorada em quatro indivíduos após avaliação do IgA, IgM e IgG com o ensaio Spike S1 em pontos de tempo que variam de pré-vacinação a quatro meses após a conclusão da série de vacinação Covid-19. As medições foram realizadas no modo dual channel (IgG/ IgM e IgA/IgM, com valores IgM médios). Todos os indivíduos receberam a vacina como imunização em duas etapas, por prática padrão, com intervalo de 21 dias entre a primeira e a segunda doses. Parcelas da resposta imune de cada sujeito são mostradas na Figura 6A-C. Os valores de resposta imune para os antígenos nucleocapsídeos e membranas foram observados em níveis de fundo para todas as imunoglobulinas avaliadas (dados não mostrados), o que foi consistente com os sujeitos que não tinham nenhuma infecção anterior do SARS-CoV-2 no tempo anterior à vacinação. No geral, os valores observados spike S1 IgA e IgM foram aproximadamente 40 vezes mais baixos que os títulos isótipos IgG, com os títulos de pico sendocresting tão logo 14 dias para isótipos IgM e IgG e o isótipo IgA atingindo picos de titulação entre a hora da segunda dose (dia 0) e 14 dias pós-dose, dependendo do assunto. Notavelmente, os títulos do Spike S1 IgG começam a se deteriorar durante os quatro meses seguintes à conclusão da vacinação a uma taxa altamente variável, de forma dependente do sujeito. Figura 1: Curvas padrão representativas de 3 plex. Curvas padrão representativas para os três analitos; apresentado como uma curva de diluição de 7 pontos, 1:5 a partir de (A) 1 μg/mL para Spike S1, (B) 5 μg/mL para membrana e (C) 1 μg/mL para nucleocásid e anticorpos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Otimização do tempo de incubação de anticorpos/amostras primárias: O sinal médio de MFI produzido a partir de diferentes tempos de incubação de anticorpos/amostras primárias (captura de anticorpos) variando de 30 min a 4 h para os padrões 1-7 (conforme indicado na Tabela 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Otimizações secundárias de concentração de anticorpos e desempenho de dois canais. As curvas ilustram a média de IM (normalizada ao maior valor registrado na série) produzida a partir de concentrações secundárias de anticorpos testados, variando de 0,5-8 μg/mL. Cada instância foi realizada tanto como um ensaio de um único e duplo canal para apreciar diferenças no formato experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Otimização de tempo de incubação de anticorpos secundários, formato dual-channel. Parcelas representativas dos valores MFI observados (normalizados ao maior valor registrado na série) no que diz respeito ao tempo de incubação com anticorpos secundários. Os experimentos foram realizados como ensaios de dois canais como (A-C) IgA/IgM ou (D-F) combinações IgG/IgM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Avaliações de especificidade para ensaios de canal duplo. Resultados do ensaio de dois canais com uma de cada combinação designada como o branco para ilustrar a falta de fluorescente ou interferência entre canais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Ilustração da soroconversão após a vacinação covid-19. Parcelas que ilustram os títulos relativos de (A) IgG, (B) IgM e (C) anticorpos IgA para o antígeno Spike S1 durante o curso da vacinação Covid-19 (Pré-vacinação – 4 meses após a conclusão); o tempo é mostrado em dias relativos ao término da série de vacinação; são indicados pontos gerais da administração da vacina (linhas vermelhas). Os experimentos foram realizados no modo dual channel, conforme descrito no Protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Número padrão Série de diluição Anti-Spike S1 ou N (μg/mL) Anti-membrana (μg/mL) Em branco Em branco – – 1 STD7 1:1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 DST3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 DST1 1:15625 0.000064 0.00032 Tabela 1: Série de diluição para curvas padrão: Tabela de fatores de diluição utilizados para as curvas padrão para o sorotipo IgG; apresentado como uma curva de diluição serial de 7 pontos, 1:5 a partir de 1 μg/mL para α-Spike S1 e α-Nucleocapsid e 5 μg/mL para anticorpos α-membrana. Analito Amostra Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Av. Sd %CV Spike S1 STD2 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 STD5 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Membrana STD2 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 STD5 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nucleocapsídeo STD2 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 STD5 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tabela 2: Precisão intra-ensaio: Coeficiente percentual de variância (%CV) calculado a partir de quatro réplicas de misturas de anticorpos padrão no padrão 2 (STD2) e padrão 5 (STD5) com um único lote de ensaio no mesmo experimento. Os valores previstos para as réplicas e médias representam os valores MFI observados. Analito Amostra Lote 1 Lote 2 Lote3 Av. Sd %CV Spike S1 STD2 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 STD5 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Membrana STD2 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 STD5 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nucleocapsídeo STD2 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 STD5 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tabela 3: Precisão de ensaio inter-ensaio com amostras padrão: Coeficiente percentual de variância (%CV) calculado a partir de três lotes distintos de ensaios, avaliados no padrão 2 e padrão 5 no mesmo experimento. Os valores previstos para as réplicas e médias representam os valores MFI observados. IgG-PE IgM-SB IgA-PE Av. MFI %CV Av. MFI %CV Av. MFI %CV Spike S1 Assunto 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Assunto 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Assunto 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Assunto 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Assunto 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nucleocapsídeo Assunto 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Assunto 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Assunto 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Assunto 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Assunto 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Membrana Assunto 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Assunto 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Assunto 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Assunto 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Assunto 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tabela 4: Precisão de ensaio inter-ensaio com amostras humanas: Coeficiente percentual médio de variância (%CV) calculado a partir de três lotes de ensaios testados com amostras de plasma (diluídos 500 vezes) de cinco indivíduos humanos com infecções por SARS-CoV-2. Spike S1 Membrana Nucleocapsídeo μg/mL Av. MFI % Max. Av. MFI % Max. Av. MFI % Max. Grão-mestre 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tabela 5: Otimização da concentração de anticorpos secundários: O sinal MFI médio produzido a partir de diferentes concentrações de anticorpos secundários variando de 0,5 μg/mL a 8 μg/mL. O valor de cada sinal também é apresentado como uma porcentagem do sinal a 8 μg/mL (“Max.”) para demonstrar magnitude relativa do sinal. Spike S1 Membrana Nucleocapsídeo Tempo de incubação (min.) Av. MFI % Max. Av. MFI % Max. Av. MFI % Max. Grão-mestre 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tabela 6: Otimização do tempo de incubação de anticorpos secundários: O sinal MFI médio produzido a partir de diferentes tempos de incubação de anticorpos secundários variando de 15 min a 120 min. O valor de cada sinal também é representado como uma porcentagem do sinal em 120 min (“Max.”) para demonstrar magnitude relativa do sinal.