Dynamisches Monitoring der Serokonversion mittels Multianalyte Immunobead Assay für Covid-19

Typische Assay-Ergebnisse und LeistungsbewertungenImmunperlen-Assays liefern üblicherweise eine sigmoidale Kurve, wenn sie über mehrere (logarithmische) Größenordnungen ausgewertet werden, wie in jedem der in Abbildung 1 dargestellten Panels dargestellt. Der Benutzer muss experimentell den optimalen Konzentrationsbereich für jeden Analyten im Multiplex definieren, um den gesamten Quantifizierungsbereich zu bestimmen, wobei sicherzustellen ist, dass die Extreme (Bereiche, die sich der unteren Quantifizierungsgrenze [LLOQ] oder der oberen Quantifizierungsgrenze [ULOQ] nähern) nicht überbewertet werden. Der tatsächliche Bereich, der für einen Assay benötigt wird, wird jedoch durch die Verteilung der Zielanalyten in einer biologischen Matrix (d. h. den “Unbekannten”) bei einem bestimmten Verdünnungsfaktor bestimmt. Obwohl Standardkurven typischerweise über lineare Regression mit einem 4- oder 5-parametrischen Anpassungsalgorithmus interpretiert werden, bietet der lineare Teil einer gegebenen Kurve typischerweise das größte Vertrauen in die quantitative Genauigkeit mit einem linearen (y = mx + b) Quantifizierungsmodell. Die Anpassung der Kalibrierkurve an die beobachteten Werte für einen Unbekannten bei einem gegebenen Verdünnungsfaktor sollte das Ziel bei der quantitativen Assay-Entwicklung sein. In diesem Zusammenhang wurde eine 7-Punkt-Standardkurve basierend auf einer seriellen Verdünnungsreihe von 1:5 für jeden der Spike S1-, Nucleocapsid- und Membran-Antikörper ausgewertet, die zwischen 1 μg/ml und 0,000064 μg/ml für Spike S1 und Nucleocapsid und 5 μg/ml und 0,00032 μg/ml für Membrane liegen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Die untere Nachweisgrenze (LLOD) für jeden Assay wurde als die niedrigste Analytkonzentration definiert, die ein von ihrem Hintergrund unterscheidbares Signal ergab. LLOD kann durch die zuvor beschriebene Gleichung 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SD-Tiefkonzentrationsprobe) identifiziert werden. LoB ist die untere Grenze von Leerwert, und es ist die “scheinbare” Konzentration des Analyten, die aus dem Rohling erzeugt wird, wenn ein Nullwert erwartet wird, und sie kann mit dieser Gleichung LoB = Mean blank + 1.645(SDblank)8 ermittelt werden. Basierend auf dieser Methode lagen die MFI-Werte für den Spike S1-Assay zwischen 134,38 und 20191,2, wobei 134,38 MFI 0,00024 μg/ml darstellte und als LLOD definiert wurde. Für den Membranassay betrug der praktische MFI-Bereich 52,24 bis 4764,9, wobei 52,24 MFI mit 0,004885 μg/ml berechnet und als LLOD zugeordnet wurde. Der MFI-Bereich für den Nucleocapsid-Assay betrug 517,9 bis 19666,34, wobei 517,9 als 0,00024 μg/ml spezifiziert wurde, was dem LLOD entsprach. Die obere Nachweisgrenze (ULOD) ist definiert als die Konzentration des Analyten, nach der die Änderung des MFI nicht mehr linear ist und die Signalantwort gesättigt ist. Es sei darauf hingewiesen, dass der vollständige sigmoidale Charakter dieser Kurven für die getesteten Standards nicht beobachtbar ist, mit Ausnahme der Nukleokapsidkurve. Angesichts der Tatsache, dass die beobachteten MFI-Werte für alle bisher untersuchten Unbekannten (bei einer Verdünnung von 1:500) jedoch innerhalb des dargestellten Kurvenbereichs für jeden Analyten liegen und leicht mit einer parametrischen 4- oder 5-parametrischen Anpassung über lineare Regression quantifiziert werden können. Assay-PräzisionIntra-Assay-Präzision: Vier Replikate von Assays wurden auf derselben Platte durchgeführt, um die Assay-Präzision zu bewerten, berechnet als %CV, oder als Quotient aus der Standardabweichung und dem Durchschnitt multipliziert mit 100. Für diese Tabellen wurden die Standardpunkte 2 und 5 ausgewählt, wobei die Werte in Tabelle 2 katalogisiert sind. Der typische akzeptable Schwellenwert für %CV-Werte beträgt ≤20 %, der für diese Daten beobachtet wurde, mit Ausnahme des Schwellenwerts für Standard 2 des Membran-IgG, der sich wahrscheinlich aus Hintergrundwerten ergibt und durch Eliminierung von Außenwerten behoben werden kann (Daten nicht gezeigt). Es sollte beachtet werden, dass eine offensichtliche Instabilität des Ablesewerts für Membranassays beobachtet wurde, bei denen die MFI-Werte <200 betrugen, am häufigsten im Fall von IgA- und IgM-Isotypen. Inter-Assay-Präzision: Für jeden Assay wurden drei verschiedene Chargen von Wulstsets vorbereitet und getestet, wie für die Intra-Assay-Präzision definiert (oben und wie in Abbildung 1 dargestellt). Die Variabilität zwischen den Assays wurde durch Berechnung des %CV aus den Durchschnittsergebnissen für jede der drei Chargen bewertet, wie in Tabelle 3 dargestellt. Auch hier wird der Schwellenwert für einen akzeptablen %CV auf ≤20% festgelegt, der für alle getesteten Bedingungen gilt (mit einem ähnlichen Effekt mit Standard 2 von Membran-IgG, wie oben gezeigt). Es sollte beachtet werden, dass die Batch-to-Batch-Variabilität der Netto-MFI-Werte häufig innerhalb mehrerer Chargen derselben Immunreagenzien während der kundenspezifischen Assay-Entwicklung beobachtet wird. Die Verwendung einer Kalibrierkurve, die aus einem kommerziell gewonnenen Anti-Ziel-Antikörper (z. B. Kaninchen-Anti-Spike-S1) mit anschließendem Antikörper zum Nachweis von Anti-Spezies aufgebaut wird, kann die Analyseergebnisse konsistent machen und Vergleiche zwischen mehreren Chargen zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermöglichen. Inter-Assay-Präzision mit menschlichen Proben: Die Bewertung der Inter-Assay-Präzision wurde mit menschlichen Plasmaproben (n = 5) wiederholt, die innerhalb eines Monats nach den ersten gemeldeten Symptomen für eine SARS-CoV-2-Infektion gesammelt wurden; durchgeführt mit drei verschiedenen Chargen von Assays (d.h. verschiedenen Präparaten der Perlensets). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt und zeigen die Genauigkeit mit einem %CV-Wert mit dem typischen oberen Grenzwert von ≤20%. Die gemittelten %CV-Werte für die Spike-S1-, Nucleocapsid- und Membran-IgG-Titer wurden mit 9,9% (Bereich 2,6%-18%), 11,0% (Bereich 3,5%-24,4%) bzw. 7,6% (Bereich 3,2%-12,9%) berechnet. Ähnliche Beobachtungen wurden mit den IgM- und IgA-Titern dieser drei Analyten gemacht, die alle %CV-Werte <20% lieferten. Die einzige Ausnahme bildeten Subject 5 IgM-Titer für das Membranprotein, die anschließend als Ausreißer ausgeschlossen wurden. Die Präzisionswerte für die Auswertungen der menschlichen Probanden stimmen mit denen überein, die oben für die Kaninchenantikörper zu sehen sind, was darauf hindeutet, dass diese Assays leicht umkonfiguriert werden können, um Titer der Antigene in mehreren Spezies mit geringem Einfluss auf die Assay-Präzision zu bewerten. Wie oben erwähnt, gab es eine offensichtliche Instabilität bei den für Membranassays beobachteten Werte, bei denen die MFI-Werte <200 lagen, am häufigsten im Fall von IgA- und IgM-Isotypen. Optimierung der primären AntikörperkonzentrationDie “Einfangzeit” des Analyten wurde mit den antigenkonjugierten Kügelchen bewertet, und die Antikörper in den Plasmaproben oder in den Standards wurden getestet, indem die Länge der primären Inkubation (30 min, 1 h, 2 h und 4 h) geändert wurde. Die Differenz im durchschnittlichen MFI wird in Abbildung 2 als Quotient aus einer bestimmten Inkubation und der maximalen Inkubationszeit, genannt % Max., zwischen einer 30-minütigen Inkubation (Mindestdauer) und einer 4-stündigen Inkubation (maximale Dauer) dargestellt. Die Werte bei 120 min waren optimal für IgG-Titer für die Spike S1-, die Membran- und die Nucleocapsid-Antikörper, was auf eine schnelle primäre Antikörperbindungskinetik hinweist, die Flexibilität zur Erhöhung des Assay-Durchsatzes ermöglicht. Für die Isotypen IgA und IgM (Daten nicht gezeigt) wurde jedoch eine langsamere Kinetik beobachtet, die Spitzeneinfangmengen zum 4-Stunden-Zeitpunkt zeigt, wie in Abbildung 2 dargestellt. Insgesamt besteht ein Gleichgewicht zwischen der nahenden Assay-Sättigung und der praktischen zeitlichen Zweckmäßigkeit für die Durchführung jedes Assays in der Produktion (zur Maximierung des Durchsatzes). Damit wurden in diesen Befunden geeignete Signale für quantitative Zwecke bei minimalen Inkubationszeiten von 30 min für IgG, 60 min für IgM und 120 min für IgA beobachtet. Optimierung der sekundären AntikörperkonzentrationFünf Konzentrationen sekundärer Antikörper (Ziegen-Anti-Human-IgG, PE-konjugiert; Ziegen-Anti-Human-IgA, PE-konjugiert; Ziegen-Anti-Human-IgM, SB-konjugiert) wurden getestet (0,5, 1, 2, 4 und 8 μg/ml). Alle Antikörper zeigten einen breiten Signalbereich, ohne offensichtliche Signalsättigung unter irgendeinem Zustand, wodurch eine lineare Messung für jede der Konzentrationen gewährleistet wurde. Zum Beispiel betrug das durchschnittliche Signal, das aus dem Spike-S1-Assay mit Ziegen-Anti-Human-IgM, SB-konjugiert bei 0,5 μg / ml erzeugt wurde, 13,2% des MFI, das aus dem maximalen Signal (8 μg / ml) erzeugt wurde, während MFI, das von 4 μg / ml erzeugt wurde, 73,3% des MFI betrug, das sich beim maximalen Signal manifestierte. Einzelheiten zum Signalspektrum der anderen Spike-S1-Antikörperisotypen, der Membranantikörper und der Nucleocapsid-Antikörper sind in Tabelle 5 und Abbildung 3 enthalten. In der Praxis spiegelt sich der primäre Einfluss zwischen der optimalen sekundären Antikörperkonzentration und der zuvor angegebenen sekundären Antikörperkonzentration von 4 μg/ml in Bezug auf die Assay-Sensitivität und die Assay-Kosten wider. Das heißt, eine sekundäre Antikörperkonzentration von 8 μg/ml kann für die Anwendung mit niedrigen Antikörpertitern oder geringen Mengen wertvoller Proben wünschenswert sein, aber die mit diesen Assays verbundenen Kosten wären erheblich höher als die Verwendung der zuvor definierten 4 μg/ml-Konzentration. Umgekehrt würden Fälle, in denen hohe Antikörpertiter beobachtet werden sollten (z. B. Personen, die Covid-19-Impfungen erlebt haben oder mit nicht limitierenden Mengen an Sera), durch die Anwendung der geringeren Mengen an sekundären Antikörpern (z. B. 1 μg / ml) ein Kosten-Nutzen-Verhältnis erzielen. Optimierung der sekundären AntikörperinkubationDer mögliche Einfluss der Dauer der sekundären Antikörperinkubation wurde ebenfalls untersucht, indem die Länge der Inkubation (15, 30, 60 und 120 min) modifiziert wurde. Im Allgemeinen überschritt die Differenz zwischen dem durchschnittlichen MFI, dargestellt als Quotient aus einer bestimmten Inkubation und der maximalen Inkubationszeit, genannt %Max, zwischen einer 15-minütigen Inkubation (Mindestdauer) und einer 120-minütigen Inkubation (maximale Dauer) 30 %, 55 % und 50 % für die Spike S1-, die Membran- bzw. die Nucleocapsid-Antikörper, was auf einen schnellen kinetischen Schritt in der sekundären Antikörperbindung und ein Mittel zur Erhöhung des Assay-Durchsatzes hinweist. Tabelle 6 enthält Details zu Signaländerungen für alle Inkubationszeiten. Abbildungen der beobachteten Signale aus verschiedenen Inkubationen dieser Analyse sind in Abbildung 4 dargestellt. Dual-Channel-Leistung und SpezifitätFür jeden Analyten wurde ein einzelner Reporter-Formatlauf (nur IgG-PE, nur IgA-PE oder nur IgM-SB) mit dem Signal verglichen, das für denselben Analyten erzeugt wurde, wenn er in einem Dual-Reporter-Format ausgeführt wurde (z. B. nur Spike S1 IgG-PE im Vergleich zu Spike S1 IgG-PE in Kombination mit Spike S1 IgM-SB im Dual-Reporter-Format). Die Assay-Präzision (ausgedrückt als %CV) für die in den beiden Formaten erzeugten Signale wurde verwendet, um die Beziehung in den Ergebnissen dieses Experiments zu analysieren. Die %CV-Werte der Spike S1-Assays betrugen 6,19 %, 16,4 % bzw. 23 % für IgM, IgG bzw. IgA. Für den Membranassay betrugen die %CV-Werte 3,3 %, 7,9 % bzw. 16,4 % für IgM, IgG bzw. IgA. Schließlich lieferte der Nucleocapsid-Assay %CV-Werte bei 8,7 %, 10,3 % bzw. 24,2 % für IgM, IgG bzw. IgA. Die für die Isotypen IgM und IgA beobachteten Präzisionswerte deuten darauf hin, dass eine längere Inkubationszeit aufgrund der bekannten kinetischen Bindungsunterschiede zwischen diesen Klassen von Immunglobulinen zu überlegenen Assay-Ergebnissen führen kann. Abbildung 4 zeigt die Übereinstimmung zwischen den Formaten der verschiedenen Konzentrationen sekundärer Antikörper. Um die Spezifität der Reporterkanäle zu bestätigen, wurde ein einzelner Reporterkanal gleichzeitig getestet, während der andere Kanal als Leerzeichen zugewiesen wurde, um sich nach dem unspezifischen Signal zu erkundigen (Blutungseffekt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es angesichts der hohen Spezifität über das gesamte Spektrum der Bedingungen eine vernachlässigbare Kreuzsignalkontamination zwischen den beiden Reporterkanälen gibt. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Insgesamt beobachteten wir eine Interferenz von 6,45% über Kanal 1 bis Kanal 2. Wenn jedoch die Größe der Signale berücksichtigt wurde, beobachteten wir die folgenden potenziellen Störpegel im Dual-Reporter-Modus: Spike IgG / IgM bei 71,98%, Spike IgA / IgM bei 28,11%; Membran-IgG/ IgM bei 7,41%, Membran-IgA/ IgM bei 134,61%; und Nukleokapsid IgG/ IgM bei 146,03%, Nukleokapsid IgA/ IgM bei 112,13%. In der angegebenen Konfiguration würde dies eine Messung von Spike-IgM in Kombination mit dem IgA-Isotyp, Membran-IgM mit dem IgM-Isotyp und Nukleokapsidmessungen erfordern, die nicht in einem Zweikanalformat durchgeführt werden. Dieser Befund könnte eine Untersuchung der Umkehrung der Kennzeichnungsstrategie erforderlich machen, bei der IgA und IgG in Kanal 2 und IgM in Kanal 1 gemessen werden. Bewertung von Serokonversionsereignissen nach der Covid-19-ImpfungDie Serokonversion wurde bei vier Probanden nach Beurteilung von IgA, IgM und IgG mit dem Spike S1-Assay zu Zeitpunkten überwacht, die von der Vorimpfung bis vier Monate nach Abschluss der Covid-19-Impfserie reichten. Die Messungen wurden im Zweikanalmodus durchgeführt (IgG/ IgM und IgA/ IgM, wobei die IgM-Werte gemittelt wurden). Alle Probanden erhielten den Impfstoff als 2-stufige Immunisierung gemäß Standardpraxis mit einem Abstand von 21 Tagen zwischen der ersten und zweiten Dose. Die Darstellung der Immunantwort jedes Probanden ist in Abbildung 6A-C dargestellt. Immunantwortwerte für die Nucleocapsid- und Membran-Antigene wurden auf Hintergrundniveaus für alle untersuchten Immunglobuline beobachtet (Daten nicht gezeigt), was mit den Probanden übereinstimmte, die in der Zeit vor der Impfung keine dokumentierte SARS-CoV-2-Infektion hatten. Insgesamt waren die beobachteten Spike-S1-IgA- und IgM-Werte etwa 40-mal niedriger als die IgG-Isotyp-Titer, wobei die Peak-Titer sowohl für die IgM- als auch für die IgG-Isotypen bereits nach 14 Tagen anstiegen und der IgA-Isotyp zwischen dem Zeitpunkt der zweiten Dosis (Tag 0) und 14 Tagen nach der zweiten Dosis Spitzentiter erreichte. je nach Thema. Insbesondere beginnen die Spike S1 IgG-Titer im Laufe der vier Monate nach Abschluss der Impfung mit einer sehr variablen Rate und subjektabhängig zu zerfallen. Abbildung 1: Repräsentative 3-Plex-Standardkurven. Repräsentative Standardkurven für die drei Analyten; dargestellt als 7-Punkt, 1:5 serielle Verdünnungskurve beginnend bei (A) 1 μg/ml für Spike S1, (B) 5 μg/ml für Membran und (C) 1 μg/ml für Nucleocapsid und Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Optimierung der Inkubationszeit des primären Antikörpers/der Probe: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Inkubationszeiten von primären Antikörpern/Proben (Antikörperabscheidung) erzeugt wird, reicht von 30 min bis 4 h für die Standards 1-7 (wie in Tabelle 1 angegeben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Optimierungen der sekundären Antikörperkonzentration und Zweikanalleistung. Die Kurven veranschaulichen den durchschnittlichen MFI (normalisiert auf den höchsten aufgezeichneten Wert in der Reihe), der aus getesteten sekundären Antikörperkonzentrationen im Bereich von 0,5-8 μg/ml hergestellt wird. Jede Instanz wurde sowohl als ein- als auch als zweikanaliger Assay durchgeführt, um Unterschiede im experimentellen Format zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Optimierung der Inkubationszeit von Sekundärantikörpern, Zweikanalformat. Repräsentative Diagramme der beobachteten MFI-Werte (normalisiert auf den höchsten aufgezeichneten Wert in der Reihe) in Bezug auf den Zeitpunkt der Inkubation mit sekundären Antikörpern. Die Experimente wurden als Zweikanal-Assays als (A-C) IgA/IgM- oder (D-F) IgG/IgM-Kombinationen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Spezifitätsbewertungen für Zweikanal-Assays. Assay-Ergebnisse des Zweikanal-Assay-Formats, wobei eine von jeder Kombination als Leerzeichen bezeichnet wird, um das Fehlen von Cross-Channel-Fluoreszenz- oder Interferenzen zu veranschaulichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Darstellung der Serokonversion nach der Covid-19-Impfung. Plots, die die relativen Titer von (A) IgG-, (B) IgM- und (C) IgA-Antikörpern für das Spike-S1-Antigen während der Covid-19-Impfung veranschaulichen (Vorimpfung – 4 Monate nach Abschluss); Die Zeit wird in Tagen relativ zum Abschluss der Impfserie angegeben; Allgemeine Punkte der Impfstoffverabreichung sind gekennzeichnet (rote Linien). Die Experimente wurden im Zweikanalmodus durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Standardnummer Verdünnungsreihe Anti-Spike S1 oder N (μg/ml) Anti-Membran (μg/ml) Leer Leer – – 1 STD7 1:1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1:15625 0.000064 0.00032 Tabelle 1: Verdünnungsreihen für Standardkurven: Tabelle der Verdünnungsfaktoren, die für die Standardkurven für den IgG-Serotyp verwendet werden; dargestellt als 7-Punkt, 1:5 serielle Verdünnungskurve beginnend bei 1 μg/ml für α-Spike S1 und α-Nucleocapsid und 5 μg/ml für α-Membran-Antikörper. Analytik Probe Vertreter 1 Vertreter 2 Vertreter 3 Vertreter 4 Ave Sd %CV Spike S1 STD2 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 STD5 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Membran STD2 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 STD5 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nukleocapsid STD2 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 STD5 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tabelle 2: Intra-Assay-Präzision: Prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus vier Replikaten von Standard-Antikörpergemischen in Standard 2 (STD2) und Standard 5 (STD5) mit einer einzigen Assay-Charge im selben Experiment. Die für Replikate und Durchschnittswerte bereitgestellten Werte stellen die beobachteten MFI-Werte dar. Analytik Probe Charge 1 Charge 2 Charge3 Ave Sd %CV Spike S1 STD2 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 STD5 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Membran STD2 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 STD5 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nukleocapsid STD2 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 STD5 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tabelle 3: Inter-Assay-Präzision mit Standardproben: Prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus drei verschiedenen Chargen von Assays, die bei Standard 2 und Standard 5 im selben Experiment ausgewertet wurden. Die für Replikate und Durchschnittswerte bereitgestellten Werte stellen die beobachteten MFI-Werte dar. IgG-PE IgM-SB IgA-PE MFI-Ave. %CV MFI-Ave. %CV MFI-Ave. %CV Spike S1 Betreff 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Betreff 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Betreff 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Fach 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Fach 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nukleocapsid Betreff 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Betreff 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Betreff 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Fach 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Fach 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Membran Betreff 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Betreff 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Betreff 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Fach 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Fach 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tabelle 4: Inter-Assay-Präzision mit menschlichen Proben: Durchschnittlicher prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus drei Chargen von Assays, die mit Plasmaproben (500-fach verdünnt) von fünf menschlichen Probanden mit SARS-CoV-2-Infektionen getestet wurden. Spike S1 Membran Nukleocapsid μg/ml MFI-Ave. % Max. MFI-Ave. % Max. MFI-Ave. % Max. Igm 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tabelle 5: Optimierung der sekundären Antikörperkonzentration: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Konzentrationen sekundärer Antikörper im Bereich von 0,5 μg/ml bis 8 μg/ml erzeugt wird. Der Wert jedes Signals wird auch als Prozentsatz des Signals bei 8 μg / ml (“Max.”) dargestellt, um die relative Signalgröße zu demonstrieren. Spike S1 Membran Nukleocapsid Inkubationszeit (min.) MFI-Ave. % Max. MFI-Ave. % Max. MFI-Ave. % Max. Igm 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tabelle 6: Optimierung der Inkubationszeit für sekundäre Antikörper: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Inkubationszeiten von sekundären Antikörpern im Bereich von 15 min bis 120 min erzeugt wird. Der Wert jedes Signals wird auch als Prozentsatz des Signals bei 120 min (“Max.”) dargestellt, um die relative Signalgröße zu demonstrieren.