Surveillance dynamique de la séroconversion à l’aide d’un test d’immunobilles multianalytes pour le Covid-19

Résultats typiques des essais et évaluations du rendementLes tests d’immunobilles fournissent généralement une courbe sigmoïdale lorsqu’ils sont évalués sur plusieurs ordres de grandeur (logarithmiques), comme illustré dans chacun des panneaux présentés à la figure 1. L’utilisateur doit définir expérimentalement la plage de concentration optimale pour chaque analyte dans le multiplex afin de déterminer la gamme complète de quantification, en veillant à ne pas suréchantillonner les extrêmes (zones approchant la limite inférieure de quantification [LLOQ] ou la limite supérieure de quantification [ULOQ]). La plage réelle requise pour un essai est toutefois dictée par la distribution des analytes cibles dans une matrice biologique (c.-à-d. les « inconnus ») à un facteur de dilution donné. De plus, bien que les courbes standard soient généralement interprétées par régression linéaire avec un algorithme d’ajustement paramétrique à 4 ou 5, la partie linéaire d’une courbe donnée fournit généralement la plus grande confiance dans la précision quantitative avec un modèle linéaire (y = mx + b) de quantification. L’adaptation de la courbe d’étalonnage aux valeurs observées pour un facteur de dilution inconnu à un facteur de dilution donné devrait être l’objectif du développement du test quantitatif. À cet égard, une courbe standard en 7 points basée sur une série de dilutions en série 1:5 a été évaluée pour chacun des anticorps Spike S1, Nucléocapside et Membrane qui varient entre 1 μg/mL et 0,000064 μg/mL pour Spike S1 et Nucleocapsid et 5 μg/mL et 0,00032 μg/mL pour Membrane, comme le montre la figure 1. La limite inférieure de détection (LLOD) pour chaque essai a été définie comme la concentration d’analyte la plus faible qui produisait un signal distinguable de son fond. LLOD peut être identifié par l’équation décrite précédemment 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (échantillonde faible concentration SD). LoB est la limite inférieure du blanc, et c’est la concentration « apparente » de l’analyte qui est produite à partir du blanc lorsqu’une valeur nulle est attendue, et elle peut être déterminée à l’aide de cette équation LoB =Blanc moyen + 1,645 (blanc SD)8. Sur la base de cette méthode, les valeurs de l’IFM pour le test Spike S1 variaient de 134,38 à 20191,2, avec 134,38 IFM représentant 0,00024 μg/ mL et défini comme llOD. Pour le test membranaire, la plage pratique d’IFM était de 52,24 à 4764,9, avec 52,24 IFM calculé à 0,004885 μg / mL et attribué comme LLOD. La gamme d’IFM pour le test nucléocapside était de 517,9 à 19666,34, avec 517,9 spécifiés comme 0,00024 μg / mL, qui était le LLOD. La limite supérieure de détection (ULOD) est définie comme la concentration d’analyte après laquelle le changement dans l’IMF n’est plus linéaire et la réponse du signal est saturée. Il convient de noter que le caractère sigmoïdal complet de ces courbes n’est pas observable pour les étalons testés, à l’exception de la courbe nucléocapside. Cependant, étant donné que les valeurs d’IFM observées pour toutes les inconnues testées à ce jour (à une dilution de 1:500) se situent dans la plage de courbes présentée pour chaque analyte et sont facilement quantifiées à l’aide d’un ajustement paramétrique de 4 ou 5 par régression linéaire. Précision du dosagePrécision intra-essai: Quatre répétitions d’essais ont été effectuées sur la même plaque pour évaluer la précision de l’essai, calculée comme le %CV, ou le quotient de l’écart-type et de la moyenne multipliée par 100. Les points standard 2 et 5 ont été sélectionnés pour ces totalisations, les valeurs étant cataloguées dans le tableau 2. Le seuil limite supérieur acceptable typique pour les valeurs %CV est ≤20 %, ce qui a été observé pour ces données, à l’exception de celui de la norme 2 des IgG membranaires, qui résulte probablement des niveaux de fond et peut être rectifié en éliminant les valeurs périphériques (données non présentées). Il convient de noter qu’une instabilité apparente de la valeur de lecture a été observée pour les essais membranaires où les valeurs de l’IFM étaient de <200, le plus souvent dans le cas des isotypes IgA et IgM. Précision entre les essais : Trois lots distincts d’ensembles de billes ont été préparés pour chaque essai et testés, comme défini pour la précision intra-essai (ci-dessus et comme le montre la figure 1). La variabilité entre les essais a été évaluée en calculant le %CV à partir des résultats moyens pour chacun des trois lots, comme le montre le tableau 3. Encore une fois, le seuil limite supérieur pour un %CV acceptable est fixé à ≤20 %, qui existe pour toutes les conditions testées (avec un effet similaire avec la norme 2 des IgG membranaires, comme on l’a vu ci-dessus). Il convient de noter que la variabilité d’un lot à l’autre des valeurs nettes d’IFM est couramment observée dans plusieurs lots des mêmes immunoréacteurs au cours de l’élaboration d’essais personnalisés. L’utilisation d’une courbe d’étalonnage érigée à partir d’un anticorps anti-cible obtenu commercialement (p. ex., anti-Spike S1 de lapin) suivie d’un anticorps de détection anti-espèce peut assurer la cohérence des résultats analytiques et permettre des comparaisons entre plusieurs lots à différentes périodes de temps. Précision inter-essais avec des échantillons humains : L’évaluation de la précision inter-essais a été répétée avec des échantillons de plasma humain (n = 5) prélevés dans le mois suivant la première notification des symptômes d’une infection par le SRAS-CoV-2; réalisé avec trois lots distincts d’essais (c.-à-d. différentes préparations des ensembles de perles). Ces résultats sont présentés dans le tableau 4 et démontrent la précision avec une valeur %CV avec la valeur limite supérieure typique de ≤20 %. Les valeurs moyennes en % CV pour les titres Spike S1, Nucleocapsid et Membrane IgG ont été calculées à 9,9 % (plage 2,6 % à 18 %), 11,0 % (plage 3,5 % à 24,4 %) et 7,6 % (plage 3,2 % à 12,9 %), respectivement. Des observations similaires ont été faites avec les titres IgM et IgA de ces trois analytes, tous fournissant des valeurs %CV <20%. La seule exception à cette règle était les titres IgM du sujet 5 pour la protéine membranaire, qui a ensuite été exclue en tant que valeur aberrante. Les valeurs de précision pour les évaluations des sujets humains sont cohérentes avec celles observées ci-dessus pour les anticorps de lapin, ce qui suggère que ces tests peuvent être facilement reconfigurés pour évaluer les titres des antigènes chez plusieurs espèces avec peu d’impact sur la précision des essais. Comme indiqué ci-dessus, il y avait une instabilité apparente des valeurs de lecture observées pour les essais membranaires où les valeurs de l’IFM étaient de <200, le plus souvent dans le cas des isotypes IgA et IgM. Optimisation de la concentration d’anticorps primairesLe « temps de capture » de l’analyte a été évalué avec les billes conjuguées à l’antigène, et les anticorps dans les échantillons de plasma ou dans les étalons ont été testés en modifiant la durée de l’incubation primaire (30 min, 1 h, 2 h et 4 h). La différence dans l’IFM moyenne est présentée comme le quotient d’une incubation spécifique et la durée maximale d’incubation, appelée % Max., dans la figure 2, entre une incubation de 30 minutes (durée minimale) et une incubation de 4 heures (durée maximale). Les valeurs à 120 min étaient optimales pour les titreurs d’IgG pour les anticorps Spike S1, membrane et nucléocapside, indiquant une cinétique de liaison rapide des anticorps primaires, permettant une flexibilité pour augmenter le débit du test. Cependant, une cinétique plus lente a été observée pour les isotypes IgA et IgM (données non présentées), démontrant des niveaux de capture de pointe au point de temps de 4 h, comme le montre la figure 2. Dans l’ensemble, il existe un équilibre entre l’approche de la saturation du test et l’opportunité pratique pour l’exécution de chaque test en production (pour maximiser le débit). Avec cela, des signaux appropriés à des fins quantitatives à des temps d’incubation minimaux de 30 min pour les IgG, 60 min pour les IgM et 120 min pour les IgA ont été observés dans ces résultats. Optimisation de la concentration d’anticorps secondairesCinq concentrations d’anticorps secondaires (IgG anti-humaines de chèvre, conjuguées à l’EP; IgA anti-humaines de chèvre, conjuguées à l’EP; IgM anti-humaines de chèvre, conjuguées SB) ont été testées (0,5, 1, 2, 4 et 8 μg/mL). Tous les anticorps ont révélé de larges gammes de signaux, sans saturation évidente du signal dans aucune condition, assurant ainsi une mesure linéaire pour l’une des concentrations. À titre d’exemple, le signal moyen généré par le test Spike S1 utilisant des IgM anti-humaines de chèvre, conjuguées SB à 0,5 μg / mL était de 13,2% de l’IMF générée à partir du signal maximal (8 μg / mL), tandis que l’IMF générée à partir de 4 μg / mL était de 73,3% de l’IMF manifestée au signal maximal. Les détails de la gamme de signaux provenant des autres isotypes d’anticorps Spike S1, des anticorps membranaires et des anticorps nucléocapsides sont inclus dans le tableau 5 et la figure 3. En pratique, l’impact primaire entre la concentration optimale d’anticorps secondaires et la concentration d’anticorps secondaires de 4 μg/mL précédemment indiquée se reflète en termes de sensibilité au test et de coût du test. Autrement dit, une concentration d’anticorps secondaires de 8 μg/mL peut être souhaitable pour une application avec de faibles titres d’anticorps ou de faibles quantités d’échantillons précieux, mais le coût associé à ces essais serait considérablement plus élevé que l’utilisation de la concentration de 4 μg/mL précédemment définie. Inversement, les cas dans lesquels des titres d’anticorps élevés devaient être observés (comme les personnes qui ont subi des vaccinations contre le Covid-19 ou avec des quantités non limitatives de sérums) verraient un rapport coût-bénéfice par l’application de quantités plus faibles d’anticorps secondaires (par exemple, 1 μg / mL). Optimisation de l’incubation d’anticorps secondairesL’influence potentielle de la durée de l’incubation secondaire des anticorps a également été étudiée en modifiant la durée de l’incubation (15, 30, 60 et 120 min). En règle générale, la différence entre l’IMF moyenne présentée comme le quotient d’une incubation spécifique et la durée maximale d’incubation, appelée %Max, entre une incubation de 15 minutes (durée minimale) et une incubation de 120 minutes (durée maximale) ne dépassait pas 30 %, 55 % et 50 % pour les anticorps Spike S1, Membrane et Nucléocapside, respectivement, indiquant une étape cinétique rapide dans la liaison secondaire des anticorps et un moyen d’augmenter le débit du test. Le tableau 6 comprend des détails sur les changements de signal pour toutes les périodes d’incubation. Des illustrations des signaux observés lors de différentes incubations de cette analyse sont présentées à la figure 4. Performances et spécificité du double canalPour chaque analyte, un seul format de rapporteur (IgG-PE uniquement, IgA-PE uniquement ou IgM-SB uniquement) a été comparé au signal généré pour le même analyte lorsqu’il a été exécuté dans un format à double rapporteur (par exemple, Spike S1 IgG-PE uniquement par rapport à Spike S1 IgG-PE en combinaison avec Spike S1 IgM-SB dans le format double rapporteur). La précision du dosage (exprimée en %CV) pour les signaux créés dans les deux formats a été utilisée pour analyser la relation dans les résultats de cette expérience. Les valeurs en % CV des tests Spike S1 étaient de 6,19 %, 16,4 % et 23 % pour les IgM, les IgG et les IgA, respectivement. Pour le test sur membrane, les valeurs de %CV étaient de 3,3 %, 7,9 % et 16,4 % pour les IgM, les IgG et les IgA, respectivement. Enfin, le test Nucleocapsid a fourni des valeurs de %CV à 8,7%, 10,3% et 24,2% pour les IgM, IgG et IgA, respectivement. Les valeurs de précision observées pour les isotypes IgM et IgA suggèrent qu’un temps d’incubation plus long pourrait conférer des résultats de dosage supérieurs en raison des différences cinétiques de liaison connues entre ces classes d’immunoglobulines. La figure 4 montre l’accord entre les formats des différentes concentrations d’anticorps secondaires. Pour confirmer la spécificité des canaux de reportage, un seul canal de reportage a été testé à un moment donné tandis que l’autre canal a été affecté en blanc pour s’enquérir du signal non spécifique (effet de saignement). Ces résultats indiquent qu’il y a une contamination négligeable des signaux croisés entre les deux canaux rapporteurs, compte tenu de la grande spécificité dans l’ensemble du spectre des conditions. Ces constatations sont illustrées à la figure 5. Dans l’ensemble, nous avons observé une interférence de 6,45 % entre le canal 1 et le canal 2. Cependant, lorsque l’ampleur des signaux a été prise en compte, nous avons observé les niveaux d’interférence potentiels suivants en mode double rapporteur : Spike IgG / IgM à 71,98%, Spike IgA / IgM à 28,11%; IgG/ IgM membranaire à 7,41 %, IgA/IgM membranaire à 134,61 %; et Nucleocapsid IgG/IgM à 146,03 %, Nucleocapsid IgA/IgM à 112,13 %. Dans la configuration spécifiée, cela nécessiterait la mesure de Spike IgM en combinaison avec l’isotype IgA, l’IgM membrane avec l’isotype IgM et les mesures nucléocapsides non effectuées dans un format à double canal. Cette constatation pourrait nécessiter l’exploration de l’inversion de la stratégie d’étiquetage selon laquelle les IgA et les IgG sont mesurées dans le canal 2 et les IgM dans le canal 1. Évaluation des événements de séroconversion suite à la vaccination contre le Covid-19La séroconversion a été surveillée chez quatre sujets lors de l’évaluation des IgA, igM et IgG avec le test Spike S1 à des moments allant de la pré-vaccination à quatre mois après la fin de la série de vaccination Covid-19. Les mesures ont été effectuées en mode double canal (IgG / IgM et IgA / IgM, avec des valeurs d’IgM moyennes). Tous les sujets ont reçu le vaccin sous forme d’immunisation en 2 étapes, selon la pratique standard, avec un intervalle de 21 jours entre la première et la deuxième dose. Les graphiques de la réponse immunitaire de chaque sujet sont présentés à la figure 6A-C. Les valeurs de réponse immunitaire pour les antigènes nucléocapside et membranaire ont été observées à des niveaux de fond pour toutes les immunoglobulines évaluées (données non présentées), ce qui était cohérent avec le fait que les sujets n’avaient pas d’infection antérieure documentée par le SRAS-CoV-2 avant la vaccination. Dans l’ensemble, les valeurs observées des IgA et des IgM spike S1 étaient environ 40 fois inférieures aux titres d’isotype IgG, les titres de pointe atteignant leur crête dès 14 jours pour les isotypes IgM et IgG et l’isotype IgA atteignant les titres de pointe entre le moment de la deuxième dose (jour 0) et 14 jours après la deuxième dose, selon le sujet. Notamment, les titres Spike S1 IgG commencent à se décomposer au cours des quatre mois suivant la fin de la vaccination à un taux très variable, en fonction du sujet. Figure 1 : Courbes standard représentatives de 3 plex. Courbes standard représentatives pour les trois analytes; présentée sous la forme d’une courbe de dilution en série de 1:5 en 7 points commençant à (A) 1 μg/mL pour Spike S1, (B) 5 μg/mL pour Membrane et (C) 1 μg/mL pour nucléocapside et anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps primaires/échantillons : Le signal MFI moyen produit à partir de différents temps d’incubation d’anticorps/échantillons primaires (capture d’anticorps) allant de 30 min à 4 h pour les étalons 1 à 7 (comme indiqué dans le tableau 1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Optimisations de la concentration d’anticorps secondaires et performances à deux canaux. Les courbes illustrent l’IFM moyenne (normalisée à la valeur la plus élevée enregistrée dans la série) produite à partir de concentrations d’anticorps secondaires testées, allant de 0,5 à 8 μg/mL. Chaque instance a été réalisée à la fois comme un test à un ou deux canaux pour apprécier les différences dans le format expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires, format double canal. Graphiques représentatifs des valeurs d’IFM observées (normalisées à la valeur la plus élevée enregistrée dans la série) en ce qui concerne le temps d’incubation avec des anticorps secondaires. Les expériences ont été réalisées sous forme de tests à double canal sous forme de combinaisons IgA/IgM (A-C) ou IgG/IgM (D-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Évaluations de la spécificité des essais à double canal. Résultats d’essai du format d’essai à double canal avec une de chaque combinaison désignée comme blanc pour illustrer l’absence de fluorescence ou d’interférence transversal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Illustration de la séroconversion suite à la vaccination contre le Covid-19. Graphiques illustrant les titres relatifs des anticorps (A) IgG, (B) IgM et (C) IgA pour l’antigène Spike S1 au cours de la vaccination contre le Covid-19 (pré-vaccination – 4 mois après l’achèvement); le temps est indiqué en jours par rapport à l’achèvement de la série vaccinale; les points généraux de l’administration du vaccin sont indiqués (lignes rouges). Les expériences ont été réalisées en mode double canal, comme décrit dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Numéro standard Série de dilution Anti-Spike S1 ou N (μg/mL) Anti-membrane (μg/mL) Blanc Blanc – – 1 STD7 1:1 1 5 2 MST6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 MST4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1:15625 0.000064 0.00032 Tableau 1 : Séries de dilution pour les courbes standard : Tableau des facteurs de dilution utilisés pour les courbes standard du sérotype IgG; présenté sous la forme d’une courbe de dilution en série de 1:5 en 7 points commençant à 1 μg/mL pour α-Spike S1 et α-nucléocapside et 5 μg/mL pour les anticorps α-Membrane. Analyte Échantillon Représentant 1 Représentant 2 Représentant 3 Représentant 4 Ave Sd %CV Pointe S1 STD2 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 MST5 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Membrane STD2 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 MST5 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nucléocapside STD2 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 MST5 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tableau 2 : Précision intra-essai : Coefficient de variance en pourcentage (%CV) calculé à partir de quatre répliques de mélanges d’anticorps standard aux normes 2 (STD2) et 5 (STD5) avec un seul lot d’essai dans la même expérience. Les valeurs fournies pour les répétitions et les moyennes représentent les valeurs d’IFM observées. Analyte Échantillon Lot 1 Lot 2 Lot3 Ave Sd %CV Pointe S1 STD2 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 MST5 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Membrane STD2 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 MST5 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nucléocapside STD2 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 MST5 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tableau 3 : Précision entre les essais avec des échantillons étalons : Coefficient de variance en pourcentage (%CV) calculé à partir de trois lots distincts de tests, évalués aux normes 2 et 5 dans la même expérience. Les valeurs fournies pour les répétitions et les moyennes représentent les valeurs d’IFM observées. IgG-PE IgM-SB IgA-PE Ave. IMF %CV Ave. IMF %CV Ave. IMF %CV Pointe S1 Sujet 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Sujet 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Sujet 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Sujet 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Sujet 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nucléocapside Sujet 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Sujet 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Sujet 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Sujet 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Sujet 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Membrane Sujet 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Sujet 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Sujet 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Sujet 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Sujet 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tableau 4 : Précision entre les essais avec des échantillons humains : Coefficient de variance moyen en pourcentage (%CV) calculé à partir de trois lots de tests testés avec des échantillons de plasma (dilué 500 fois) de cinq sujets humains atteints d’infections par le SRAS-CoV-2. Pointe S1 Membrane Nucléocapside μg/mL Ave. IMF % Max. Ave. IMF % Max. Ave. IMF % Max. Igm 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tableau 5 : Optimisation de la concentration d’anticorps secondaires : Signal MFI moyen produit à partir de différentes concentrations d’anticorps secondaires allant de 0,5 μg/mL à 8 μg/mL. La valeur de chaque signal est également présentée sous forme de pourcentage du signal à 8 μg/mL (« Max. ») pour démontrer l’amplitude relative du signal. Pointe S1 Membrane Nucléocapside Temps d’incubation (min.) Ave. IMF % Max. Ave. IMF % Max. Ave. IMF % Max. Igm 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tableau 6 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires : Le signal MFI moyen produit à partir de différents temps d’incubation d’anticorps secondaires allant de 15 min à 120 min. La valeur de chaque signal est également représentée en pourcentage du signal à 120 min (« Max. ») pour démontrer l’amplitude relative du signal.