Covid-19 için Multianalit İmmünoboncuk Testi Kullanılarak Serokonversiyonun Dinamik İzlenmesi

Tipik tahlil sonuçları ve performans değerlendirmeleriİmmünoboncuk tahlilleri, Şekil 1’de sunulan panellerin her birinde gösterildiği gibi, birkaç (log) büyüklük sırasına göre değerlendirildiğinde genellikle bir sigmoidal eğri sağlar. Kullanıcı, tüm kantitasyon aralığını belirlemek için multipleks içindeki her analit için en uygun konsantrasyon aralığını deneysel olarak tanımlamalı ve aşırı uçları (kantitasyonun alt sınırına [LLOQ] veya kantitasyonun üst sınırına [ULOQ] yaklaşan alanlar) aşırı örneklememeyi sağlamalıdır. Bununla birlikte, bir tahlil için gereken gerçek aralık, hedef analitlerin biyolojik bir matristeki (yani ‘bilinmeyenler’) belirli bir seyreltme faktöründeki dağılımı ile belirlenir. Ayrıca, standart eğriler tipik olarak 4 veya 5 parametrik bir uyum algoritması ile doğrusal regresyon yoluyla yorumlansa da, belirli bir eğrinin doğrusal kısmı tipik olarak doğrusal (y = mx + b) bir niceleme modeli ile nicel doğrulukta en büyük güveni sağlar. Kalibrasyon eğrisini, belirli bir seyreltme faktöründe bilinmeyen bir için gözlemlenen değerlerle eşleştirmek, nicel tahlil geliştirmede amaç olmalıdır. Bu bağlamda, Spike S1, Nükleokapsid ve Membran antikorlarının her biri için, Spike S1 ve Nucleocapsid için 1 μg / mL ile 0.000064 μg / mL ve Membran için 5 μg / mL ve Membran için 5 μg / mL ve 0.00032 μg / mL arasında değişen 1:5 seri seyreltme serisine dayanan 7 noktalı bir standart eğri değerlendirilmiştir. Her tahlil için alt tespit sınırı (LLOD), arka planından ayırt edilebilir bir sinyal veren en düşük analit konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır. LLOD, daha önce 8,9, LLOD = LoB + 1.645 (SDdüşük konsantrasyonlu numune) olarak tanımlanan denklemle tanımlanabilir. LoB, boşluğun alt sınırıdır ve sıfır değeri beklendiğinde boşluktan üretilen “görünür” analit konsantrasyonudur ve bu denklem kullanılarak tespit edilebilir LoB = Ortalama boş + 1.645 (SDboş)8. Bu yönteme dayanarak, Spike S1 testi için MFI değerleri 134.38 ile 20191.2 arasında değişmiş, 134.38 MFI 0.00024 μg / mL’yi temsil etmekte ve LLOD olarak tanımlanmaktadır. Membran testi için pratik MFI aralığı 52.24 ila 4764.9 idi, 52.24 MFI 0.004885 μg / mL olarak hesaplandı ve LLOD olarak atandı. Nükleokapsid testi için MFI aralığı 517.9 ila 19666.34 idi ve 517.9, LLOD olan 0.00024 μg / mL olarak belirtildi. Algılamanın üst sınırı (ULOD), MFI’daki değişimin artık doğrusal olmadığı ve sinyal yanıtının doygun olduğu analit konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bu eğrilerin tam sigmoidal karakterinin, Nükleokapsid eğrisi hariç, test edilen standartlar için gözlemlenemediğine dikkat edilmelidir. Bununla birlikte, bugüne kadar test edilen tüm bilinmeyenler için gözlemlenen MFI değerleri göz önüne alındığında (1:500 seyreltmede), her analit için sunulan eğri aralığındadır ve doğrusal regresyon yoluyla 4 veya 5 parametrik bir uyum kullanılarak kolayca ölçülür. Tahlil hassasiyetiTahlil içi hassasiyet: Tahlil hassasiyetini değerlendirmek için aynı plaka üzerinde dört tahlil replikası yapıldı, %CV veya standart sapmanın bölümü olarak hesaplandı ve ortalama 100 ile çarpıldı. Bu tablolar için standart noktalar 2 ve 5 seçilmiştir ve değerler Tablo 2’de kataloglanmıştır. %CV değerleri için tipik kabul edilebilir üst sınır eşiği, bu veriler için gözlemlenen %≤20’dir, ancak Membran IgG’nin standart 2’si hariç, muhtemelen arka plan seviyelerinden kaynaklanır ve dış değerler ortadan kaldırılarak düzeltilebilir (veriler gösterilmemiştir). MFI değerlerinin <200 olduğu Membran tahlillerinde, en yaygın olarak IgA ve IgM izotipleri durumunda, okuma değerinde belirgin bir kararsızlık gözlendiği belirtilmelidir. Tahliller arası hassasiyet: Her tahlil için üç ayrı boncuk seti grubu hazırlanmış ve Tahlil İçi hassasiyet için tanımlandığı şekilde test edilmiştir (yukarıda ve Şekil 1’de görüldüğü gibi). Tahliller arası değişkenlik, Tablo 3’te gösterildiği gibi, üç partinin her biri için ortalama sonuçlardan %CV hesaplanarak değerlendirilmiştir. Yine, kabul edilebilir bir %CV için üst sınır eşiği, test edilen tüm koşullar için mevcut olan ≤20% olarak ayarlanmıştır (yukarıda görüldüğü gibi, standart 2 Membran IgG ile benzer bir etkiyle). Net MFI değerlerindeki partiden partiye değişkenliğin, özel tahlil geliştirme sırasında aynı immünoreaktiflerin çoklu partileri içinde yaygın olarak gözlendiği belirtilmelidir. Ticari olarak elde edilen bir anti-hedef antikorundan (örneğin, tavşan anti-Spike S1) ve ardından bir anti-tür tespit antikorundan oluşturulan bir kalibrasyon eğrisinin kullanılması, analitik sonuçlarda tutarlılık sağlayabilir ve farklı zaman dilimlerinde çoklu partiler arasında karşılaştırmalara izin verebilir. İnsan örnekleriyle tahliller arası hassasiyet: Tahliller arası hassasiyetin değerlendirilmesi, SARS-CoV-2 enfeksiyonu için ilk bildirilen semptomlardan sonraki bir ay içinde toplanan insan plazma örnekleri (n = 5) ile tekrarlandı; üç ayrı tahlil grubuyla (yani, boncuk setlerinin farklı preparatları) gerçekleştirilir. Bu sonuçlar Tablo 4’te gösterilmiştir ve tipik üst eşik sınır değeri %≤20 olan %CV değeri ile hassasiyeti göstermektedir. Spike S1, Nucleocapsid ve Membrane IgG titreleri için ortalama %CV değerleri sırasıyla %9.9 (dağılım %2.6-), .0 (dağılım %3.5-.4) ve %7.6 (dağılım %3.2-.9) olarak hesaplandı. Benzer gözlemler bu üç analitin IgM ve IgA titreleri ile yapıldı ve hepsi %CV değerleri %<20 sağladı. Bunun tek istisnası, daha sonra aykırı değer olarak dışlanan Membran proteini için Subject 5 IgM titreleriydi. İnsan denek değerlendirmeleri için hassasiyet değerleri, tavşan antikorları için yukarıda görülenlerle tutarlıdır, bu da bu testlerin, tahlil hassasiyeti üzerinde çok az etkisi olan birden fazla türdeki antijenlerin titrelerini değerlendirmek için kolayca yeniden yapılandırılabileceğini düşündürmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, MFI değerlerinin <200 olduğu Membran tahlilleri için gözlemlenen değerleri, en yaygın olarak IgA ve IgM izotipleri durumunda, okumada belirgin bir kararsızlık vardı. Birincil antikor konsantrasyonu optimizasyonuAnalit ‘yakalama süresi’ antijen konjuge boncuklarla değerlendirildi ve plazma numunelerindeki veya standartlardaki antikorlar, birincil inkübasyonun uzunluğunu değiştirerek test edildi (30 dakika, 1 saat, 2 saat ve 4 saat). Ortalama MFI’daki fark, Şekil 2’de 30 dakikalık bir inkübasyon (minimum süre) ile 4 saatlik bir inkübasyon (maksimum süre) arasındaki belirli bir inkübasyonun bölümü ve % Maksimum olarak adlandırılan maksimum inkübasyon süresi olarak sunulmaktadır. 120 dakikadaki değerler, Spike S1, Membran ve Nükleokapsid antikorları için IgG titreleri için optimaldi, bu da hızlı birincil antikor bağlayıcı kinetik olduğunu ve tahlil verimini artırma esnekliğine izin verdiğini gösteriyordu. Bununla birlikte, IgA ve IgM (veriler gösterilmemiştir) izotipleri için daha yavaş kinetikler gözlenmiştir ve Şekil 2’de gösterildiği gibi 4 saatlik zaman noktasında pik yakalama seviyelerini göstermiştir. Genel olarak, yaklaşan tahlil doygunluğu ile üretimdeyken her tahlilin çalıştırılması için pratik zaman uygunluğu arasında bir denge vardır (verimi en üst düzeye çıkarmak için). Bununla birlikte, bu bulgularda IgG için 30 dakika, IgM için 60 dakika ve IgA için 120 dakika minimum inkübasyon sürelerinde nicel amaçlar için uygun sinyaller gözlenmiştir. İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonuBeş konsantrasyonda ikincil antikor (keçi anti-insan IgG, PE-konjuge edilmiş; keçi anti-insan IgA, PE-konjuge edilmiş; keçi anti-insan IgM, SB-konjuge edilmiş) test edildi (0.5, 1, 2, 4 ve 8 μg / mL). Tüm antikorlar, herhangi bir koşulda belirgin bir sinyal doygunluğu olmadan geniş sinyal aralıkları ortaya çıkardı, böylece konsantrasyonların herhangi biri için doğrusal bir ölçüm sağladı. Örnek olarak, 0.5 μg / mL’de SB-konjuge edilmiş keçi anti-insan IgM kullanılarak Spike S1 testinden üretilen ortalama sinyal, maksimum sinyalden (8 μg / mL) üretilen MFI’nin% 13.2’si iken, 4 μg / mL’den üretilen MFI, maksimum sinyalde ortaya çıkan MFI’nın% 73.3’ü idi. Diğer Spike S1 antikor izotiplerinden, Membran antikorlarından ve Nükleokapsid antikorlarından gelen sinyal aralığının ayrıntıları Tablo 5 ve Şekil 3’te yer almaktadır. Pratik bir nokta olarak, optimal sekonder antikor konsantrasyonu ile daha önce belirtilen 4 μg/mL sekonder antikor konsantrasyonu arasındaki birincil etki, tahlil duyarlılığı ve tahlil maliyeti açısından yansıtılmaktadır. Yani, düşük antikor titreleri veya düşük miktarlarda değerli numune ile uygulama için 8 μg / mL’lik bir ikincil antikor konsantrasyonu istenebilir, ancak bu testlerle ilişkili maliyet, daha önce tanımlanmış 4 μg / mL konsantrasyonunun kullanımından oldukça yüksek olacaktır. Tersine, yüksek antikor titrelerinin gözlenmesi gereken durumlar (Covid-19 aşıları yaşamış veya sınırlayıcı olmayan miktarlarda serumlu bireyler gibi), daha düşük miktarlarda ikincil antikorların (örneğin, 1 μg / mL) uygulanması yoluyla bir maliyet-fayda görecektir. İkincil antikor inkübasyon optimizasyonuİkincil antikor inkübasyon süresinin potansiyel etkisi, inkübasyonun uzunluğunu (15, 30, 60 ve 120 dakika) değiştirerek de araştırılmıştır. Genel olarak, belirli bir inkübasyonun bölümü olarak sunulan ortalama MFI ve %Max olarak adlandırılan maksimum inkübasyon süresindeki fark, 15 dakikalık bir inkübasyon (minimum süre) ile 120 dakikalık bir inkübasyon (maksimum süre) arasındaki fark, Spike S1, Membran ve Nükleokapsid antikorları için sırasıyla% 30,% 55 ve% 50’yi geçmemiştir ve sekonder antikor bağlanmasında hızlı bir kinetik adım ve tahlil verimini arttırmanın bir yolunu göstermektedir. Tablo 6 , tüm inkübasyon süreleri için sinyal değişiklikleri hakkında ayrıntılar içermektedir. Bu analizin farklı inkübasyonlarından gözlemlenen sinyallerin çizimleri Şekil 4’te gösterilmiştir. Çift kanallı performans ve özgüllükHer analit için, tek bir muhabir biçimi çalıştırması (yalnızca IgG-PE, yalnızca IgA-PE veya yalnızca IgM-SB), çift raporlayıcı biçiminde çalıştırıldığında aynı analit için üretilen sinyalle karşılaştırılmıştır (örneğin, çift raporlayıcı biçiminde Spike S1 IgM-SB ile birlikte yalnızca Spike S1 IgG-PE’ye karşı Spike S1 IgG-PE). Bu deneyin bulgularındaki ilişkiyi analiz etmek için iki formatta oluşturulan sinyaller için tahlil hassasiyeti (% CV olarak ifade edilir) kullanılmıştır. Spike S1 testlerinin %CV değerleri IgM, IgG ve IgA için sırasıyla %6.19, .4 ve idi. Membran testi için, %CV değerleri IgM, IgG ve IgA için sırasıyla% 3.3,% 7.9 ve% 16.4 idi. Son olarak, Nükleokapsid testi, IgM, IgG ve IgA için sırasıyla% 8.7,% 10.3 ve% 24.2’de % CV değerleri sağlamıştır. IgM ve IgA izotipleri için gözlenen hassasiyet değerleri, daha uzun bir inkübasyon süresinin, bu immünoglobulin sınıfları arasında bilinen bağlayıcı kinetik farklılıklar nedeniyle üstün tahlil sonuçları verebileceğini düşündürmektedir. Şekil 4 , sekonder antikorların farklı konsantrasyonlarının formatları arasındaki anlaşmayı göstermektedir. Muhabir kanallarının özgüllüğünü doğrulamak için, bir kerede tek bir muhabir kanalı test edilirken, diğer kanal spesifik olmayan sinyali (kanama etkisi) sorgulamak için boş olarak atandı. Bu bulgular, koşulların spektrumundaki yüksek özgüllük göz önüne alındığında, iki muhabir kanalı arasında ihmal edilebilir çapraz sinyal kontaminasyonu olduğunu göstermektedir. Bu bulgular Şekil 5’te gösterilmiştir. Genel olarak, kanal 1’den kanal 2’ye kadar% 6.45’lik bir girişim gözlemledik. Bununla birlikte, sinyallerin büyüklüğü hesaba katıldığında, ikili muhabir modunda aşağıdaki potansiyel girişim seviyelerini gözlemledik: Spike IgG / IgM% 71.98, Spike IgA / IgM% 28.11; %7.41’de membran IgG/ IgM, 4.61’de Membran IgA/ IgM; ve 6.03’te Nükleokapsid IgG / IgM, 2.13’te Nükleokapsid IgA/ IgM. Belirtilen konfigürasyonda bu, Spike IgM’nin IgA izotipi, IgM izotipi ile Membran IgM ve çift kanallı bir formatta gerçekleştirilmeyen nükleokapsid ölçümleri ile kombinasyon halinde ölçülmesini gerektirecektir. Bu bulgu, IgA ve IgG’nin kanal 2’de ve IgM’nin Kanal 1’de ölçüldüğü etiketleme stratejisinin tersine çevrilmesinin araştırılmasını gerektirebilir. Covid-19 aşılaması sonrası serokonversiyon olaylarının değerlendirilmesiIgA, IgM ve IgG’nin değerlendirilmesi üzerine dört denekte serokonversiyon, aşılama öncesinden Covid-19 aşılama serisinin tamamlanmasından dört ay sonrasına kadar değişen zaman noktalarında Spike S1 testi ile izlendi. Ölçümler çift kanallı modda gerçekleştirildi (IgG / IgM ve IgA / IgM, IgM değerleri ortalaması alındı). Tüm denekler aşıyı, standart uygulamaya göre, birinci ve ikinci dozlar arasında 21 günlük bir aralıkla 2 aşamalı bir bağışıklama olarak aldı. Her deneğin bağışıklık tepkisinin grafikleri Şekil 6A-C’de gösterilmiştir. Nükleokapsid ve Membran antijenleri için immün yanıt değerleri, değerlendirilen tüm immünoglobulinler için arka plan seviyelerinde gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir), bu da aşılamadan önceki dönemde belgelenmiş SARS-CoV-2 enfeksiyonu olmayan deneklerle tutarlıdır. Genel olarak, gözlenen Spike S1 IgA ve IgM değerleri, IgG izotip titrelerinden yaklaşık 40 kat daha düşüktü, pik titreler hem IgM hem de IgG izotipleri için 14 gün gibi kısa bir sürede tepeleniyordu ve IgA izotipi, ikinci dozun zamanı (0. gün) ile ikinci dozdan sonraki 14 gün arasında pik titrelere ulaşıyordu. konuya bağlı olarak. Özellikle, Spike S1 IgG titreleri, aşılamanın tamamlanmasını takip eden dört ay boyunca, konuya bağlı bir şekilde, oldukça değişken bir oranda çürümeye başlar. Resim 1: Temsili 3 katlı standart eğriler. Üç analit için temsili standart eğriler; Spike S1 için (A) 1 μg/mL, Membran için (B) 5 μg/mL ve Nükleokapsid ve antikorlar için (C) 1 μg/mL’den başlayan 7 noktalı, 1:5 seri seyreltme eğrisi olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Birincil antikor/numune inkübasyon süresi optimizasyonu: Birincil antikor/numunelerin (antikor yakalama) farklı inkübasyon sürelerinden üretilen ortalama MFI sinyali, 1-7 standartları için 30 dakika ile 4 saat arasında değişmektedir (Tablo 1’de belirtildiği gibi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonları ve çift kanallı performans. Eğriler, 0.5-8 μg / mL arasında değişen, test edilmiş ikincil antikor konsantrasyonlarından üretilen ortalama MFI’yi (seride kaydedilen en yüksek değere normalleştirilmiş) göstermektedir. Her örnek, deneysel formattaki farklılıkları takdir etmek için hem tek hem de çift kanallı bir tahlil olarak gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: İkincil antikorların kuluçka süresi optimizasyonu, çift kanallı format. Sekonder antikorlarla inkübasyon zamanına göre gözlemlenen MFI değerlerinin (seride kaydedilen en yüksek değere normalleştirilmiş) temsili grafikleri. Deneyler (A-C) IgA/IgM veya (D-F) IgG/IgM kombinasyonları gibi çift kanallı tahliller halinde yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Çift kanallı tahliller için özgüllük değerlendirmeleri. Çift kanallı tahlil formatının tahlil sonuçları, kanallar arası floresan veya parazit eksikliğini göstermek için her kombinasyondan biri boş olarak belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Covid-19 aşılamasını takiben serokonversiyonun gösterimi. Covid-19 aşılaması sırasında Spike S1 antijeni için (A) IgG, (B) IgM ve (C) IgA antikorlarının göreceli titrelerini gösteren grafikler (Aşılama öncesi – tamamlanmadan 4 ay sonra); zaman, aşılama serisinin tamamlanmasına göre gün cinsinden gösterilir; aşı uygulamasının genel noktaları belirtilmiştir (kırmızı çizgiler). Deneyler, Protokol’de açıklandığı gibi çift kanal modunda gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Standart Numara Seyreltme serisi Ani Yükselme Önleyici S1 veya N (μg/mL) Anti-Membran (μg/mL) Boş Boş – – 1 STD7 1:1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 01:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1:15625 0.000064 0.00032 Tablo 1: Standart eğriler için seyreltme serisi: IgG serotipi için standart eğriler için kullanılan seyreltme faktörleri tablosu; α-Spike S1 ve α-Nucleocapsid için 1 μg/mL’den başlayan 7 noktalı, 1:5 seri seyreltme eğrisi ve α-Membran antikorları için 5 μg/mL olarak sunulmaktadır. Arjantin Örnek Temsilci 1 Temsilci 2 Temsilci 3 Temsilci 4 Ave Sd %CV Başak S1 STD2 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 STD5 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Zar STD2 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 STD5 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nükleokapsid STD2 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 STD5 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tablo 2: Tahlil içi hassasiyet: Standart 2 (STD2) ve standart 5’teki (STD5) standart antikor karışımlarının dört replikasyonundan hesaplanan yüzde varyans katsayısı (%CV), aynı deneyde tek bir tahlil partisi ile hesaplanmıştır. Çoğaltmalar ve ortalamalar için sağlanan değerler, gözlemlenen MFI değerlerini temsil eder. Arjantin Örnek Toplu İşlem 1 Toplu İş 2 Toplu 3 Ave Sd %CV Başak S1 STD2 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 STD5 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Zar STD2 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 STD5 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nükleokapsid STD2 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 STD5 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tablo 3: Standart numunelerle tahliller arası hassasiyet: Varyans yüzdesi katsayısı (%CV), aynı deneyde standart 2 ve standart 5’te değerlendirilen üç ayrı tahlil grubundan hesaplanmıştır. Çoğaltmalar ve ortalamalar için sağlanan değerler, gözlemlenen MFI değerlerini temsil eder. IgG-PE IgM-SB IgA-PE Av. MFI %CV Av. MFI %CV Av. MFI %CV Başak S1 Konu 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Konu 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Konu 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Konu 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Konu 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nükleokapsid Konu 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Konu 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Konu 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Konu 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Konu 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Zar Konu 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Konu 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Konu 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Konu 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Konu 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tablo 4: İnsan numuneleri ile tahliller arası hassasiyet: SARS-CoV-2 enfeksiyonları olan beş insan denekten alınan plazma örnekleriyle (500 kat seyreltilmiş) test edilen üç grup tahlilden hesaplanan ortalama yüzde varyans katsayısı (%CV). Başak S1 Zar Nükleokapsid μg/mL Av. MFI % Maks. Av. MFI % Maks. Av. MFI % Maks. Igm 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tablo 5: İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonu: Ortalama MFI sinyali, 0.5 μg / mL ila 8 μg / mL arasında değişen farklı ikincil antikor konsantrasyonlarından üretilir. Her sinyalin değeri, göreceli sinyal büyüklüğünü göstermek için 8 μg / mL’de (“Maks.”) sinyalin bir yüzdesi olarak da sunulur. Başak S1 Zar Nükleokapsid Kuluçka süresi (min.) Av. MFI % Maks. Av. MFI % Maks. Av. MFI % Maks. Igm 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tablo 6: İkincil antikor inkübasyon süresi optimizasyonu: Sekonder antikorların farklı inkübasyon sürelerinden üretilen ortalama MFI sinyali, 15 dakika ila 120 dakika arasında değişmektedir. Her sinyalin değeri, göreceli sinyal büyüklüğünü göstermek için 120 dakikada (“Maks.”) sinyalin bir yüzdesi olarak da temsil edilir.