Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Die neuronale Netzhaut ist ein sehr organisiertes Gewebe, das gut definierte neuronale Schichten aufweist. In diesen sind Neuronen (Ganglien-, Amakrin-, bipolare, horizontale und Photorezeptorzellen) miteinander und auch mit Müller-Gliazellen (MGCs) und Astrozyten verbunden, was zu einer adäquaten Phototransduktion und Verarbeitung visueller Informationen^{führt 1,2}. Es ist bekannt, dass MGCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielen, da sie den gesamten Netzhautabschnitt durchqueren und somit mit allen Zelltypen interagieren können, die mehrere Schutzprozesse modulieren. Es wurde berichtet, dass MGCs mehrere wichtige Funktionen für die Erhaltung und das Überleben von retinalen Neuronen haben, einschließlich Glykolyse zur Energieversorgung von Neuronen, die Entfernung von neuronalen Abfällen, das Recycling von Neurotransmittern und die Freisetzung neurotropher Faktoren, unter anderem ^3,4,5.

Auf der anderen Seite sind Entzündungen, oxidativer und nitrosativer Stress an der Pathogenese und dem Fortschreiten vieler menschlicher Krankheiten beteiligt, einschließlich der Retinopathien 6,7,8,9,10,11. Das Redoxgleichgewicht in den Zellen hängt von einer strengen Regulierung der ROS-Werte ab. ROS werden ständig unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich durch aerobe Atmung erzeugt. Zu den Hauptmitgliedern der ROS-Familie gehören reaktive freie Radikale wie das Superoxid-Anion (O_2͘͘͘͘^•−), Hydroxylradikale (•OH), verschiedene Peroxide (ROOR′), Hydroperoxide (^ROOH) und das radikalfreie Wasserstoffperoxid (_H2O2)^12,13. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass ROS eine wichtige Signalisierungsrolle in den Zellen spielt, indem es essentielle Prozesse steuert. MGCs haben eine starke antioxidative Abwehr durch die Aktivierung des transkriptionellen Kernfaktors Erythroid-2-verwandter Faktor 2 (Nrf2) und die anschließende Expression von antioxidativen Proteinen, um die übermäßige Produktion von ROS unter pathologischen Bedingungen^{zu beseitigen 14,15,16}. Wenn die Zellen ihr Redoxgleichgewicht aufgrund einer übertriebenen Produktion von ROS oder einer mangelhaften Fähigkeit, ROS zu entfernen, verlieren, fördert die Anhäufung von oxidativem Stress schädliche Veränderungen in Proteinen, Lipiden und DNA, was zu zellulärem Stress oder Tod führt. Die Erhöhung des retinalen antioxidativen Abwehrsystems verbessert die Auflösung und Vorbeugung von Retinopathien wie ROP und RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daher ist die Messung der ROS-Produktion in Echtzeit ein leistungsfähiges und nützliches Werkzeug.

Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Quantifizierung des Redoxzustands einer Zelle^25,26,27,28. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht ihre Spaltung durch intrazelluläre Esterasen an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt, 2′,7′-Dichlorfluorescein (H2 DCF), entsteht_. Dieses nicht-fluoreszierende Molekül reichert sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt DCF. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS (Peroxynitrit, Hydroxylradikale, Stickstoffmonoxid oder Peroxide), die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie (Emission bei 530 nm und Anregung bei 485 nm) nachgewiesen werden können. Die Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass Superoxid und Wasserstoffperoxid nicht stark mit_H2DCF^25,29 reagieren. In diesem Artikel verwenden wir die DCFH-DA-Sonde, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Aus diesem Grund induzieren wir die ROS-Produktion, indem wir MGCs mit ROS-Induktor, A oder B, stimulieren, bevor wir die Zellen mit der Fluoreszenzsonde beladen. Darüber hinaus verwenden wir eine antioxidative Verbindung. Schließlich zeigen wir repräsentative und zuverlässige Daten, die mit diesem Protokoll erhalten wurden.